生化與分子生物學(xué)技術(shù)原理課件

生化與分子生物學(xué)

技術(shù)原理

2006年11月第一章核酸的基本結(jié)構(gòu)和性質(zhì)一.基本的化學(xué)組成經(jīng)不同程度水解可獲得核酸各種組成部分

核苷酸nucleotideNt

核苷nucleosideNs

堿基嘌呤purinePu嘧啶pyrimidinePy堿基三字符號(hào)AdeCytGuaThyUraNs單字符號(hào)(d)ACGTUNs,Nt,oligoNts中均為D-戊糖

堿基可異構(gòu)化異構(gòu)平衡僅H原子位置變化UV,NMR分析生理pH條件下,5種堿基99.99%以氨基與酮式存在。酮式烯醇式氨基亞胺

抗生素第二信使嘌呤霉素細(xì)胞激動(dòng)素能源庫(kù)輔酶二.糖環(huán)的折疊形式

構(gòu)型(configuration)共價(jià)化合物中,各個(gè)原子在空間的相對(duì)排列關(guān)系。構(gòu)型的改變涉及到共價(jià)鍵破壞核酸中核糖僅一種構(gòu)型：β-D型

構(gòu)象(conformation)化合物內(nèi)可以自由轉(zhuǎn)動(dòng)的單鍵上的原子或基團(tuán),繞單鍵旋轉(zhuǎn)或隨單鍵扭轉(zhuǎn),產(chǎn)生幾種不同的空間排列形式。構(gòu)象的改變并不伴隨共價(jià)鍵的破壞

核酸中的核糖有多種構(gòu)象

核糖的五員環(huán)不處于一個(gè)平面，C1，，O，和C4’

三個(gè)原子在一個(gè)平面上，C2’或/和C3’

偏離此平面，使核糖產(chǎn)生不同的構(gòu)象。

?內(nèi)式構(gòu)象(endo)偏離平面的方向和C5’同向?外式構(gòu)象(exo)偏離平面的方向和C5’反向2.扭轉(zhuǎn)式(Twist,T)

糖環(huán)的C2’

和C3’

兩個(gè)原子都偏離糖平面,而且取方向相反的折疊。兩個(gè)原子偏離糖平面的程度可以相等或不等C2’-endo-C3’-exoC2’-exo-C3’-endo側(cè)視圖?存在溶液:Nt,NsC2’-endo~C3’-endoDNA:B-DNAC2’-endoA-DNA(RNA)C3’-endoZ-DNA胞苷(C)C2’-endo(反式）

鳥(niǎo)苷(G)C3’-endo（順式）(B-formdoubleDNA)(A-formdoubleDNA)C2’-endoC3’-endo1.修飾堿基60余種

UraAdeGuaCytThy

25171262?堿基上原子被其他基團(tuán)取代mpom……?AA衍生物Base-CO-NH-AA?糖衍生物Base-CH2OH-糖(6C)?非嘌呤,嘧啶衍生物(tRNA)W異丙烯GuatRNAanticodon3’鄰位Q7-去N-GuatRNAanticodon擺動(dòng)位2.修飾核糖RNAC2’-OH甲基化(Nm)

抗水解(Rnase,[OHˉ])二聚體

NmpNp3.糖苷鍵不同

假尿苷

ψ(tRNArRNA)C5-C1’

糖苷鍵4.

修飾符號(hào)m1Am7G

CmΨmm2Gm3G22.2.7?tRNA60余種分布在環(huán)區(qū) anticodonloop高度修飾QW

?SnRNAuRNA5’-endCapm3G2.2.7

?稀有堿基的形成

酶催化-CH3

堿基交換Q

tRNA鳥(niǎo)嘌呤糖苷轉(zhuǎn)移酶G34(tRNA)Q34(tRNA)QGuaN-糖苷鍵打斷、重建

b.DNA

?~10種甲基化

?形成

合成時(shí)om5dC參入

phageT2.4.6

合成后甲基化m5dCm6dAm4dCDNA甲基化酶S-腺苷甲硫氨酸（甲基供體）

*dam–

半甲基化產(chǎn)物積累b.真核生物DNA甲基化

?

甲基化在兩條鏈上,對(duì)稱分布

真核生物5’-mCpG-3’

植物5’-mCNG-3’dCmdC影響DNA-蛋白質(zhì)相互作用

?甲基化格式具有組織專一性patternofmethylation

格式變化:配子發(fā)生時(shí)期,胚胎發(fā)育早 期,病毒感染格式維持:DNA甲基化酶維持配子和體 細(xì)胞甲基化狀態(tài)甲基化格式的維持C*CGGCCGGCCGG甲基化格式的限制性內(nèi)切酶分析?甲基化與基因表達(dá)雞珠蛋白基因的組織特異性分析(MsplHpall)CpG表達(dá)(紅細(xì)胞）mCpG不表達(dá)（腎、腦……)

肌動(dòng)蛋白(actingene)表達(dá)高速率轉(zhuǎn)錄

肌肉細(xì)胞 actingene actingene(CpG) (mCpG) 成纖維細(xì)胞低速率轉(zhuǎn)錄

?Promoter-CpG-甲基化與轉(zhuǎn)錄

γ-globingene–200—+90有甲基化基團(tuán)mCpG轉(zhuǎn)錄受阻

除去部分mCpG轉(zhuǎn)錄受阻

除去所有CpG轉(zhuǎn)錄

5-氮胞苷抑制甲基化,瞬時(shí)去甲基化

5-NC?

成纖維細(xì)胞

肌肉細(xì)胞(多核,有條紋,可收縮)?甲基化與小鼠胚胎發(fā)育

knockout甲基轉(zhuǎn)移酶geneC胚胎發(fā)育早期甲基化格式變換,其后細(xì)胞內(nèi)DNA維持特定的甲基化狀態(tài)配子發(fā)生期,不同性別配子的甲基化格式是特定的。其區(qū)別使父母等位基因在胚胎中表達(dá)不同。下一代配子保持相同格式

Igf2geneIGF-Ⅱ胰島素-like生長(zhǎng) 因子依賴于父本表達(dá)

Igf2RgeneIGF-ⅡR胰島素-like生長(zhǎng) 因子受體依賴于母本表達(dá)一條X-染色體的失活?甲基化格式的建立、維持和改變從無(wú)到有(denovo)甲基化雙鏈相對(duì)-CpG--mCpG-確立新格式甲基化的維持脫甲基被動(dòng)復(fù)制后不再甲基化主動(dòng)甲基轉(zhuǎn)移堿基切除修復(fù)?CpG-richislands

基因組中存在異常非甲基化-CpG-順序簇

高含量C+G

高頻率CGdimer(10/100bp)

分布不均,長(zhǎng)1-2kb，間隔~(yú)100kb

非甲基化–CpG

存在：housekeepinggenestissuesspecificgenes5’-啟動(dòng)子——轉(zhuǎn)錄區(qū)

腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶CpG密度1/100bpCpG密度10/100bp

–100~300

1.二氫葉酸還原酶基因2.次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖酶基因3.核糖體蛋白質(zhì)基因123CGmCG抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)MeCP-1*CpG成簇MeCP-2*CpGDNA甲基化有助于基因關(guān)閉五.核酸及其化學(xué)組分的化學(xué)反應(yīng)1.水解反應(yīng)磷酸二酯鍵,磷酸單酯鍵,N-糖苷鍵a.酶水解b.酸堿水解

?

磷酸二酯鍵

?酸熱強(qiáng)酸dA,dG0.1NHCl30mi（100°C) rA,rG1MHCl60minrC,rU12MHClO460min?堿DNA不作用RNA鄰接基團(tuán)參與效應(yīng),生成磷酸 基轉(zhuǎn)移中間物,水解。?

N-糖苷鍵堿穩(wěn)定酸不穩(wěn)定DNA>RNAdNs>Ns嘌呤Ns>嘧啶Ns

酸堿作用比較DNARNA

堿

/ 2’or3’-Nt產(chǎn)物

酸Pu,Py,Pu,PyNt,

多聚核糖-P碎片

碎片

磷酸二酯鍵

嘧啶糖苷鍵

穩(wěn)

大

? ?

定

?

嘧啶糖苷鍵

磷酸二酯鍵

性

小 ??

嘌呤糖苷鍵

嘌呤糖苷鍵2.β-消除反應(yīng)

連接磷酸基團(tuán)的

β-C原子上有強(qiáng)的吸電子基團(tuán)存在時(shí),引起

α-C原子和O原子間的鍵斷裂。OHR–P–O–CH2–CH2–Z

(–CHO,>C=O,–HC=N<)Oα

β

DNAandRNA化學(xué)法測(cè)序主鏈斷開(kāi)3.堿基上反應(yīng)a.烷基化反應(yīng)(-CH3)

堿基上除PuN-9,PyN-1外,所有N和O原子

均可因親電攻擊而甲基化。

?溫和(Soft)烷化劑

硫酸二甲酯甲基硫烷烷基化物

DMSMMSMeIMeNG-N7

>A-N1

>C-N3

>T-N3DMS作用于dsDNAA-N3(Me),阻止DNApol.

?強(qiáng)(Hard)烷化劑

N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)

N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)MeN,O核酸50%磷酸酯烷化

烷化劑直接致癌DMSG-O6:G-N7=0.004:1MNUG-O6:G-N7=0.08:1(肝)G-O6:G-N7=0.15:1(腦)G-N7(Me)不改變G:C配對(duì)G-O6(Me)不影響DNApol,但改變堿基對(duì), GT

b.鹵化反應(yīng)

嘧啶5位5-FU抗癌藥

鹵素分子

嘌呤8位8-BrPu標(biāo)記c.與醛類反應(yīng)堿基的環(huán)外–NH2AMP:N6-NH2GMP:N2-NH2

甲醛是DNA不可逆變性劑

?鑒定ssDNAordsDNA

?破壞RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)，消除結(jié)構(gòu)對(duì)電泳遷移 率的影響d.核糖上的反應(yīng)?核糖的氧化反應(yīng)

核糖的2’，3’-順二醇被高碘酸(HIO4)氧化成順二醛，胺催化β-消除反應(yīng)，同時(shí)堿基脫落,生成磷酸，堿基和糖碎片。5’-Nt定量測(cè)定RNA序列測(cè)定

?

核糖的脫水反應(yīng)酸性條件下，核糖或脫氧核糖脫水產(chǎn)物與試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)?？捎枚ㄌ欠ū壬珳y(cè)定DNAorRNA含量。

?

苔黑酚法測(cè)RNA

核糖

糠醛

?

二苯胺法測(cè)DNA

脫氧核糖

ω-羥基-γ-酮基戊醛-3H2O-2H2O六.核酸組分的分離鑒定

1.分離

a.電泳分離NtanddNtNt(dNt)的解離及pK值pH3.5，Nts間凈電荷

差異最大.

ADP質(zhì)子化狀態(tài)

b.層析

?離子交換層析高效液相層析(HPLC)

?稀有成分纖維素薄板雙向?qū)游?/p>

靈敏,快速,穩(wěn)定。20種3’-Nt,22種5’-Nt,40種Ns,14種抗水

解NmNpdimer.AmGp~GmAp CmUp~UmCp2.鑒定a.標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(電泳,層析)UV吸收檢出吸收UV藍(lán)紫色斑點(diǎn),G藍(lán)色熒光,D無(wú)吸收。

b.紫外光譜鑒定?溶液樣品在220-290nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描,確定

λmaxandλmin,對(duì)照參數(shù)(特定pH)。

例:pH6-7λmaxλminA260227G253223 C271250

U262230 T267236

?不同波長(zhǎng)下吸收比值A(chǔ)250/A260A280/A260A290/A260

注意點(diǎn):

?一般

λmax250-280,λmin220-250

吸收曲線特征與pH相關(guān),pH1,7,12下測(cè)定。

?Base與

Ns吸收值差異大Ns~dNs~NmNs~Nt~dNt

?Gua類在酸性時(shí),UV下蘭色熒光,光譜曲線有 肩。

?稀有成分的吸收光譜特征常不同于常見(jiàn)成分

第二章核酸的分離純化一.細(xì)胞中的核酸

1.存在狀態(tài)與蛋白質(zhì)結(jié)合(除tRNA)2.分布DNA:原核核質(zhì)區(qū)真核95%核內(nèi) 5%核外（mt,ct)RNA:原核胞質(zhì)真核90%質(zhì)(15%細(xì)胞器）10%核3.含量少,細(xì)胞干重5-15%,10ˉ15-10ˉ10g/cell4.大小RNA104-106DaDNA＞106Da二.制備中注意事項(xiàng)保持生物學(xué)功能,具有生物活性分子完整,天然狀態(tài)(未變性)1.簡(jiǎn)化步驟2.避免高溫0-4℃3.避免過(guò)酸或過(guò)堿pH5-94.防止機(jī)械剪切作用（shearing)5.防止核酸酶降解作用

5.防止核酸酶降解作用a.DNase活性需要Me2+(Mg2+,Ca2+,Mn2+……)螯合劑?SSC檸檬酸三鈉-NaCl?EDTA-Na2乙二胺四乙酸鈉(Me2+)?EGTA乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+特異性)b.RNase活性不需Me2+，熱穩(wěn)定，回復(fù)能力強(qiáng).

●防止外源RNase污染污染源：器皿、溶液、操作者．

措施

?180℃高溫處理數(shù)小時(shí)

?

0.1%

DEPC（二乙基焦碳酸鹽)處理

OO蛋白變性劑 C2H5–O–C–O–C–O–C2H5

共價(jià)修飾RNase

?操作者

●抑制內(nèi)源RNase盡早、徹底去蛋白

?非專一性吸附劑RNase堿性蛋白（pI9.6）,中性pH下 靜電吸附．皂土、復(fù)合硅酸鹽（Macaloid）、多聚陰 離子（肝素、聚乙烯硫酸酯）．

?蛋白變性劑

異硫氰酸胍、SDS（十二烷基硫酸鈉）破細(xì)胞同時(shí)使RNase失活?RNase抑制劑RNasin465aa酸性蛋白（鼠肝、人胎盤）與RNase結(jié)合，保護(hù)RNA,不用于提取．

?核苷酸底物類似物–—競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑ApUpRNaseAG2’-5’GRNaseT1三.核酸的分離提取總核酸目的核酸細(xì)胞器目的核酸1.破細(xì)胞

?物理法石英沙研磨、超聲、勻漿、搗碎器．

?化學(xué)法去污劑、蛋白變性劑破膜

?生化法溶菌酶、蛋白酶

動(dòng)、植物材料液N2,機(jī)械破碎細(xì)菌溶菌酶水解肽聚糖破壁培養(yǎng)細(xì)胞去污劑與蛋白酶破膜破膜用去污劑

?SDSC12-H25-O-SO3Na＋0.5-2%終濃度[Na+]≧1MSDS↓影響CsCl梯度

?Sarkosyl（十二烷基肌氨酸鈉）3%終濃度

?異硫氰酸胍

?非離子型去污劑TritonX-100、Brij58作用溫和、膜部 分破2．解聚核蛋白并除蛋白a.去污劑核酸pI2-2.5SDS結(jié)合蛋白質(zhì)濃KAc+SDS→SDS-K↓

b．有機(jī)溶劑酚、氯仿蛋白質(zhì)變性劑酚、酚／氯仿－異戊醇、氯仿－異戊醇注意：防剪切力（振蕩速度、大口吸管），處理酚（重蒸、緩沖液飽和、0.1%8-羥基喹啉）c．ProteinaseK處理廣譜,水解力強(qiáng),可在SDS,EDTA存在下作用．3．核酸的沉淀a．乙醇核酸的Na,K鹽在乙醇中↓?調(diào)節(jié)鹽濃度：0.1MNaCl,0.3MNaAc,2.5MNH4Ac?加2-2.5V冷乙醇（﹥95%）攪出DNA或離心↓?70-75%乙醇洗滌去鹽除盡EtOH,干燥?溶于TE(10mMTrisHClpH8.0,1mMEDTA)?核酸濃度﹤0.1μg/ml,加助沉淀劑?重復(fù)沉淀，補(bǔ)鹽!

b．異丙醇0.3MNaAc,0.6-1V選擇性沉淀DNAand大RNA,體積小，不需低溫放置．沸點(diǎn)高，鹽↓，須EtOH洗滌．

4.雜質(zhì)的去除a.小分子雜質(zhì)b.多糖?樣品預(yù)處理動(dòng)物饑餓 植物暗化?選擇性沉淀

?異丙醇糖與小分子RNA不↓

?CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）

CH3

|

CH3(CH3)15–N+–CH3

+NA–

/\

CH3CH3

CTANA

?

NaNA?(EtOH)+CTAAc（溶）

Br-0.1MNaAc70%EtOH1%CTAB-0.35MNaCl多糖溶解

c.RNA與DNA互為雜質(zhì)DNP溶于1-2MNaClRNP溶于0.14MNaCl

?除RNARNase(100℃,15min處理,除DNase)

?除DNARNase-freeDNase5.保存防止降解、變性措施：滅菌、低溫、鹽濃度、pH、EDTA……DNATEbuffer,4-–20℃,70%EtOHRNA冰凍干燥、低溫6.純度的初步鑒定a.UV吸收曲線b.UV吸收比值DNAA260/A280=1.8RNAA260/A280=2.0

核酸的含量測(cè)定(260nm,1cm光徑)1A26050μg/mldsDNA40μg/mlssDNA,RNA36μg/mloligoNtsc.膠電泳定量,定性四.核酸的純化1.超離心a.類型?沉降速度法被分離物質(zhì)在強(qiáng)大的離心力場(chǎng)中因沉降速度不同而分離.(速度區(qū)帶超離心).?沉降平衡法被分離物質(zhì)在離心時(shí)因浮密度不同進(jìn)行分離.(浮密度梯度or等密度梯度超離心).

?

浮密度ρ是溶劑化密度,即核酸銫鹽水化物(CsCl,H2O,NA)的密度.

?

不同介質(zhì)下,核酸的ρ不同.CsClρDNA=1.71;Cs2SO4

ρDNA=1.45

?pH不同,堿基結(jié)合Cs﹢量不同,ρ值不同.

沉降速度超離心沉降平衡超離心原理沉降速度不同浮密度不同梯度物質(zhì)蔗糖0-70%CsCl0-7.355M密度1-1.3470密度1-1.9052 ﹤NA密度 包含ρDNA1.71離心力場(chǎng)強(qiáng)5-6萬(wàn)rpm稍強(qiáng)3-5萬(wàn)rpmNA↓CsCl成梯度分子運(yùn)動(dòng)向管底5S小↑or↓于等密度處16SrRNA↓(ds,ss,cc,oc,l 23S 大DNARNA)離心時(shí)間較短免于↓管底長(zhǎng)1-2天時(shí)間過(guò)長(zhǎng)失敗不變操作制備梯度→鋪樣→離CsCl+樣品→混勻 心→收集 →離心→收集應(yīng)用RNA,ssDNA,限制性DNA酶切片段

b.沉降平衡超離心法的應(yīng)用

?

測(cè)ρ?測(cè)(G+C)%ρ=1.660+0.098(G+C)%天然、線狀、dsDNA,修飾少.(G+C)%~20–80%?RNA,DNA和蛋白質(zhì)的分離中性CsClρRNA1.9,ρDNA1.7,ρ蛋白1.3-1.4ρ:RNA>RNA·DNA>DNA>蛋白質(zhì)

?ρ值不同的dsDNA的分離(ρ值差0.01-0.02)影響ρ值的因素：

?(G+C)%

?甲基化,ρ?

?重原子取代ρN15>ρN14

?

重金屬原子結(jié)合Cs2SO4Ag+

GC-richHg2+

AT-rich

?堿性CsCl離心分離DNA兩條互補(bǔ)鏈dsDNA變性→pH12-12.5CsCl離心→兩個(gè) 峰（兩條ssDNA）變性DNA輕鏈（L） 重鏈（H）G+T比例高，ρ大pH12下,G-N1andT-N3解離，結(jié)合Cs+多， ρ升高.

?分離不同構(gòu)型DNA

DNA結(jié)合具插入作用藥物(溴乙錠EB),ρ值降低.cc,oc和lDNA結(jié)合藥物的量不同,ρ變化不同.ccDNA結(jié)合少；oc和lDNA結(jié)合多.純化質(zhì)粒ccDNA,除RNA,oc,lDNA和染色體 DNA.

2.膠電泳快速、簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品用量少……a.原理核酸pI=2-2.5,pH8-8.3時(shí),NA帶負(fù)電荷.

*PipK1=1,pK2=6完全解離

*

-+NH=-NH=pK=2.4-4.4完全解離

*-NH--N-+H+pK=9.4-10基本未解離核酸分子大小不同,荷質(zhì)比相同.荷/質(zhì)=n+1/n

電泳緩沖液:TAETris-NaAc-EDTApH8.3TBETris-Boricacid-EDTApH8.3

-

b.膠類型的選

?agarosegel0.2~50kb(恒電場(chǎng))30~10,000kb(交變脈沖電場(chǎng)）?PAGE5~1000bp,分辨率1bp

192-5-13-29-32-39-49-60溫度(電壓)對(duì)遷移率的影響鹽濃度對(duì)遷移率的影響c.核酸高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)分離的影響

?分子量相同,構(gòu)型不同,遷移率不同遷移率:cc>l