標(biāo)記抗體技術(shù)

標(biāo)記抗體技術(shù)第1頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

抗原與抗體能特異性結(jié)合，但抗體、抗原分子小，在含量低時(shí)形成的抗原抗體復(fù)合物是不可見(jiàn)的。有一些物質(zhì)即使在超微量時(shí)也能通過(guò)特殊的方法將其檢測(cè)出，如果將這些物質(zhì)標(biāo)記在抗體分子上，可以通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記分子來(lái)顯示抗原抗體復(fù)合物的存在，根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性和標(biāo)記分子的敏感性建立的技術(shù)，稱(chēng)為標(biāo)記抗體技術(shù)(labeledantibodytechnique)。

第2頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五高敏感性的標(biāo)記分子主要有熒光素、酶、放射性同位素3種，由此建立免疫熒光抗體技術(shù)、免疫酶標(biāo)記技術(shù)和放射免疫分析。其特異性和敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)血清學(xué)方法，被廣泛應(yīng)用于病原微生物鑒定、傳染病的診斷、分子生物學(xué)中的基因表達(dá)產(chǎn)物分析等各個(gè)領(lǐng)域。第3頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五熒光素和熒光酶

發(fā)光器官主要靠?jī)煞N物質(zhì)產(chǎn)生光，一種叫熒光素，另一種叫熒光酶。當(dāng)熒光素被一定波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)就會(huì)產(chǎn)生光，而熒光酶則是一種催化劑，它能幫助熒光素與氧結(jié)合產(chǎn)生氧化反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生光。深海動(dòng)物發(fā)出的光是一種不發(fā)熱的“冷光”，由于發(fā)光動(dòng)物含有的熒光素和熒光酶不同，因此發(fā)出的光的顏色也不同，主要有橙、紅、黃、綠、藍(lán)、紫、白等顏色，但以藍(lán)綠色光居多。

第4頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五熒光素和熒光酶

大多數(shù)發(fā)光生物是通過(guò)自己身體內(nèi)的熒光素和熒光酶產(chǎn)生光，而少數(shù)發(fā)光生物則是依靠寄生在其發(fā)光器內(nèi)的發(fā)光性細(xì)菌發(fā)光，例如有一種閃光魚(yú)，在其發(fā)光器內(nèi)寄生著上百億個(gè)發(fā)光細(xì)菌。有些水母只能通過(guò)吃掉其他發(fā)光動(dòng)物才能發(fā)光。

第5頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)

FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。四乙基羅丹明(rhodamine,RB200)RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。

常見(jiàn)的熒光素第6頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?/p>

常見(jiàn)的熒光素第7頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素，紅色熒光。酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì):某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。辣根過(guò)氧化物酶。藍(lán)色常見(jiàn)的熒光素第8頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五碘化丙啶（propidiumiodide，PI）：可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對(duì)中。紅色熒光

多甲藻葉綠素蛋白

（peridininchlorophyllprotein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物。深紅色常見(jiàn)的熒光素第9頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五生物學(xué)、化學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的特殊試劑：藻藍(lán)蛋白還是一種十分稀有的色素蛋白，具有熒光特性，當(dāng)受光激發(fā)，可發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，用于腫瘤和癌癥的臨床體外診斷上，對(duì)細(xì)胞的早期癌變?cè)\斷意義重大，可作為一種新型的光敏劑。藻藍(lán)蛋白藻紅蛋白第10頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

流式細(xì)胞儀測(cè)定常用的熒光染料有多種,它們分子結(jié)構(gòu)不同，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時(shí)必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(zhǎng)(如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長(zhǎng)633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等。第11頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五它們的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別是：

染料名激發(fā)光波長(zhǎng)（ηm）

發(fā)射光峰值（ηm）

FITC

488

525（綠）

PE

488

575（橙紅）

PI

488

630（橙紅）

ECD

488

610（紅）

CY5

488

675（深紅）

PreCP

488

675（深紅）第12頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五合適熒光素的選擇：

（1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。

（2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。

（3）熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。

（4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性。

（5）標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。

（6）安全無(wú)毒。第13頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五免疫熒光抗體技術(shù)(immunofluorescenceantibodytechnique)是指用熒光素對(duì)抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，然后用熒光顯微鏡觀察熒光以分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。其中，最常用的是以熒光素標(biāo)記抗體或抗抗體，用于檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。第1節(jié)免疫熒光抗體技術(shù)第14頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五免疫熒光抗體標(biāo)記技術(shù)最早是由Coons等于1941年建立的。當(dāng)時(shí)是用異氰酸熒光黃(fluorescein

isocyanate，F(xiàn)IC)來(lái)標(biāo)記抗體，用于檢測(cè)小白鼠組織切片中可溶性肺炎球菌多糖。但由于FIC分子難于標(biāo)記到抗體分子上，因而限制了該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。直到后來(lái)發(fā)現(xiàn)異硫氰酸熒光素(FITC)和其他熒光素分子，以及熒光抗體純化技術(shù)的發(fā)展，顯著提高了熒光抗體標(biāo)記技術(shù)的敏感性和特異性，才使這一技術(shù)在病原微生物的檢測(cè)、傳染病的診斷、腫瘤抗原研究等方面得到了廣泛的應(yīng)用。第15頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosis，SLE)患者血清中出現(xiàn)抗細(xì)胞核抗體

（ANA）。以小白鼠肝細(xì)胞核作為抗原基質(zhì)，加病人血清(第一抗體)，再加熒光標(biāo)記的抗人IgG(第二抗體)進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，若患者血清中有ANA，即與肝細(xì)胞核抗原結(jié)合，再與熒光標(biāo)記的抗人IgG結(jié)合，在熒光顯鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核顯示黃綠色特異熒光。第16頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二、熒光素

熒光素是能夠產(chǎn)生明顯熒光，并能作為染料使用的有機(jī)化合物，又稱(chēng)為熒光色素。只有具備共軛鍵系統(tǒng)，即單鍵、雙鍵交替的分子，才有可能使激發(fā)態(tài)保持相對(duì)穩(wěn)定而發(fā)射熒光，具有此類(lèi)結(jié)構(gòu)的主要是以苯環(huán)為基礎(chǔ)的芳香族化合物和一些雜環(huán)化合物。

第17頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二、熒光素

作為蛋白質(zhì)標(biāo)記用的熒光素尚須具備：①有與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)，而不形成有害產(chǎn)物；②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合的需要量很??；⑧結(jié)合物在一般貯存條件下穩(wěn)定，結(jié)合后不影響抗體的免疫活性；④作為組織學(xué)標(biāo)記，結(jié)合物的熒光必須與組織的自發(fā)熒光(背景顏色)有良好的反襯，以便能清晰地判斷結(jié)果；⑤結(jié)合程序簡(jiǎn)單，能制成直接應(yīng)用的商品，可長(zhǎng)期保存。第18頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五可用于標(biāo)記的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)和四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC，其中應(yīng)用最廣的是FITC，羅丹明只是作為前者的補(bǔ)充，用作對(duì)比染色時(shí)標(biāo)記。第19頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4種主要熒光素的化學(xué)結(jié)構(gòu)第20頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三、熒光抗體染色方法(一)標(biāo)本制備

1、標(biāo)記要求：標(biāo)本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并盡可能減少形態(tài)變化，抗原位置保持不變。同時(shí)還必須使抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物易于接受激發(fā)光源，以便良好地觀察和記錄。這就要求標(biāo)本要相當(dāng)薄，并要有適宜的固定處理方法。第21頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三、熒光抗體染色方法(一)標(biāo)本制備

2、標(biāo)本處理方法：細(xì)菌培養(yǎng)物、感染動(dòng)物的組織或血液、膿汁、糞便、尿沉渣等，可用涂片或壓印片。組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和感染組織主要采用冰凍切片或低溫石蠟切片。也可用生長(zhǎng)在蓋玻片上的單層細(xì)胞培養(yǎng)作標(biāo)本。細(xì)胞培養(yǎng)可用胰酶消化后作成涂片。細(xì)胞或原蟲(chóng)懸液可直接用熒光抗體染色后，再轉(zhuǎn)移至玻片上直接觀察。第22頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三、熒光抗體染色方法(一)標(biāo)本制備

3、標(biāo)本固定的目的：有兩個(gè)目的，一是防止被檢材料從玻片上脫落；二是消除抑制抗原抗體反應(yīng)的因素(如脂肪)。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的抗原，用有機(jī)溶劑固定可增加細(xì)胞膜的通透性而有利于熒光抗體滲入。最常用的固定劑為丙酮和95％乙醇。固定后應(yīng)隨即用PBS反復(fù)沖洗，干后即可用于染色。第23頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)染色方法熒光抗體染色法有多類(lèi)，常用的有直接法和間接法。1、直接法：直接滴加2～4個(gè)單位的標(biāo)記抗體于標(biāo)本區(qū)，置濕盒中，于37℃染色30min左右，然后大量PBS（pH7.0～7.2）中漂洗15min，干燥、封載即可鏡檢。直接法應(yīng)設(shè)以下對(duì)照：標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照和陰性標(biāo)本對(duì)照。直接法用于檢測(cè)抗原，每檢測(cè)一種抗原均需制備相應(yīng)的熒光抗體。第24頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2、間接法：將標(biāo)本先滴加特異性的抗血清，置濕盒中，于37℃作用30min，漂洗后，再用標(biāo)記的第2抗體(抗抗體)染色，漂洗、干燥、封載。對(duì)照除自發(fā)熒光、陽(yáng)性和陰性對(duì)照外，間接法首次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)無(wú)中間層對(duì)照(標(biāo)本+標(biāo)記抗抗體)和陰性血清對(duì)照(中間層用陰性血清代替特異性抗血清)。既可用于檢測(cè)抗原，又可用于檢測(cè)抗體，而且制備一種熒光抗抗體即可用于同種屬動(dòng)物的多種抗原抗體系統(tǒng)的檢測(cè)。第25頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第26頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五五、免疫熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用（一）、細(xì)菌學(xué)診斷

利用免疫熒光抗體技術(shù)可直接檢出或鑒定新分離的細(xì)菌，具有較高的敏感性和特異性。鏈球菌、致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌屬、布氏桿菌、炭疽桿菌等均可采用免疫熒光抗體染色進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。糞便、黏膜拭子涂片、病變組織的觸片或切片以及尿沉渣等均可作為檢測(cè)樣本，經(jīng)直接法檢出目的菌，具有很高的診斷價(jià)值。第27頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五五、免疫熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用（一）、細(xì)菌學(xué)診斷

對(duì)含菌量少的標(biāo)本，可采用濾膜集菌法，然后直接在濾膜上進(jìn)行免疫熒光染色，這一方法已在水的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)調(diào)查、海水細(xì)菌動(dòng)力學(xué)研究中得到應(yīng)用。第28頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五以較低濃度的熒光抗體加入培養(yǎng)基中，進(jìn)行微量短期的玻片培養(yǎng)，于熒光顯微鏡下直接觀察熒光集落的“熒光菌球法”，已廣泛用于下痢糞便中的病原體檢測(cè)。尤其對(duì)于已用藥物治療的患者，在病因?qū)W診斷上有較大價(jià)值，因?yàn)樵谶@種情況下培養(yǎng)病原體常難于成功。

五、免疫熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用（一）、細(xì)菌學(xué)診斷

第29頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五免疫熒光抗抗體間接染色法檢測(cè)抗體，可用于流行病學(xué)調(diào)查、早期診斷和現(xiàn)癥診斷。如鉤端螺旋體IgM抗體的檢測(cè)，可作為早期診斷或近期感染的指征。用間接法檢出結(jié)核分支桿菌的抗體，可以作為對(duì)結(jié)核病的活動(dòng)性和化療監(jiān)控的重要手段。五、免疫熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用（一）、細(xì)菌學(xué)診斷

第30頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)病毒病診斷

用免疫熒光抗體技術(shù)直接檢出患畜病變組織中的病毒，已成為病毒感染快速診斷的重要手段。一般可在2h內(nèi)做出診斷報(bào)告。病原的鑒別診斷。

五、免疫熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第31頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)病毒病診斷對(duì)含病毒較低的病理組織，需先在細(xì)胞培養(yǎng)上短期培養(yǎng)增殖后，再用熒光抗體檢測(cè)病毒抗原，可提高檢出率。某些病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上不出現(xiàn)細(xì)胞病變，亦可應(yīng)用免疫熒光作為病毒增殖的指征。應(yīng)用間接免疫熒光染色法以檢測(cè)血清中的病毒抗體，亦常作為診斷和流行病學(xué)調(diào)查之用，尤以IgM型抗體的檢出可供早期診斷和作為近期感染的指征。五、免疫熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第32頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(三)其他方面的應(yīng)用

免疫熒光抗體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞CD分子和膜表面免疫球蛋白(mIg)的檢測(cè)，從而為淋巴細(xì)胞的分類(lèi)和亞型鑒定提供研究手段。用抗IgM和IgG的抗血清標(biāo)記SPA熒光菌體作熒光SPA花環(huán)試驗(yàn)，可計(jì)算帶有mIgM或mIgG的B細(xì)胞的百分率。五、免疫熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第33頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

免疫酶標(biāo)記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一大新型的血清學(xué)技術(shù)。1966年，Nakane等和Avrameas等分別報(bào)道用酶代替熒光素標(biāo)記抗體，建立了酶標(biāo)抗體技術(shù)(enzyme-labelledantibodytechnique)，用于生物組織中抗原的定位和鑒定。1971年，Engvall，VanWeemen等報(bào)道了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，從而建立了酶標(biāo)抗體的定量檢測(cè)技術(shù)。20世紀(jì)80年代，基于酶標(biāo)記抗體檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)分子的免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)問(wèn)世。目前，免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測(cè)和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。第2節(jié)免疫酶標(biāo)記技術(shù)第34頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、原理

酶標(biāo)抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化反應(yīng)的高敏感性而建起來(lái)的免疫檢測(cè)技術(shù)。酶是一種有機(jī)催化劑，催化反應(yīng)過(guò)程中酶不被消耗，能反復(fù)作用，微量的酶即可導(dǎo)致大量的催化過(guò)程，如果產(chǎn)物為有色可見(jiàn)產(chǎn)物，則極為敏感。其催化過(guò)程是：E+S(ES)E+P；或E+S(ES),(ES)+D1E+P+D2式中：E為酶；S為酶作用底物；P為底物分解后的產(chǎn)物；D1

為供氫體，無(wú)色，底物水解時(shí)，D1由還原型變?yōu)檠趸虳2，呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。第35頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶標(biāo)抗體技術(shù)的基本程序是：①將酶分子與抗原或抗體分子共價(jià)結(jié)合，既不改變抗體免疫活性，也不影響酶的催化活性；②將酶標(biāo)抗體(抗抗體)與存在于組織細(xì)胞或吸附于固相載體上的抗原(抗體)發(fā)生特異性結(jié)合，并洗下未結(jié)合的物質(zhì)；③滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解過(guò)程中由另外的供氫體提供氫離子，使供氫體由無(wú)色的還原型變?yōu)橛猩难趸停尸F(xiàn)顏色反應(yīng)。第36頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五可根據(jù)底物溶液的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)。顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原(抗體)的量呈正比。此種有色產(chǎn)物可用肉眼或在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下看到，或用分光光度計(jì)加以測(cè)定。這樣，就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，用以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、納克水平上測(cè)定它們的量。本法既特異又敏感，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種免疫檢測(cè)方法之一。第37頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二、用于標(biāo)記的酶用于標(biāo)記的酶應(yīng)具有如下一些特點(diǎn)：①高度的特異活性和敏感性；②在室溫下穩(wěn)定；③易于獲得并能商品化生產(chǎn)；④與底物反應(yīng)的產(chǎn)物易于顯現(xiàn)。常用的有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以辣根過(guò)氧化物酶應(yīng)用最廣，其次為堿性磷酸酶。第38頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(一)辣根過(guò)氧化物酶

過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱(chēng)為辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)。HRP是由五色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白(含糖18％)，分子質(zhì)量約為40ku。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化時(shí)需要供氫體，使產(chǎn)生一定顏色的產(chǎn)物。如果聯(lián)苯胺為供氫體，反應(yīng)式如下：二、用于標(biāo)記的酶第39頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五凡能在HRP催化H2O2生成H20過(guò)程中提供氫，而后自己生成有色產(chǎn)物的化合物(供氫體)都可用作顯色劑。HRP的供氫體很多，根據(jù)供氫體的產(chǎn)物可分為兩類(lèi)：①可溶性供氫體：產(chǎn)生有色的可溶性產(chǎn)物，可用比色法測(cè)定，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中的顯色劑，常用的鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)，顯色呈橙色，最大吸收波長(zhǎng)為490nm，可用肉眼判定；3,3’,5,5’四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，顯色呈藍(lán)色，加氰氟酸終止，在650nm波長(zhǎng)下測(cè)定，若用硫酸終止(變?yōu)辄S色)則在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定。二、用于標(biāo)記的酶(一)辣根過(guò)氧化物酶第40頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五②不溶性供氫體：產(chǎn)生不溶性的產(chǎn)物，最常用的是3，3’二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)，反應(yīng)后的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物，可用光學(xué)顯微鏡和肉眼觀察。用于各種免疫酶組織化學(xué)染色法、斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫轉(zhuǎn)印。免疫酶組織化學(xué)染色斑點(diǎn)雜交免疫轉(zhuǎn)印第41頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)：從小牛腸黏膜和大腸桿菌中提取。AKP的底物種類(lèi)很多，常用對(duì)硝基苯磷酸鹽，酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶性，最大吸收波長(zhǎng)為400nm。二、用于標(biāo)記的酶第42頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(三)葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GO)，系從曲霉中提取，對(duì)底物葡萄糖的作用常借過(guò)氧化物酶及其顯色底物來(lái)加以顯現(xiàn)。如顯色底物為鄰苯二胺，則反應(yīng)后呈棕色，陰性者為淡黃色，極易用目視法判別，其靈敏度高于過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體。二、用于標(biāo)記的酶第43頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五戊二醛法或過(guò)碘酸鈉氧化法將酶標(biāo)記于抗體分子。三、抗體的酶標(biāo)記第44頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五四、常用的免疫酶標(biāo)記技術(shù)(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)1、標(biāo)本的制備和處理:用于免疫酶染色的標(biāo)本有組織切片(冷凍切片和低溫石蠟切片)、組織壓印片、涂片以及細(xì)胞培養(yǎng)的單層細(xì)胞蓋片等。這些標(biāo)本的制作和固定與熒光抗體技術(shù)相同，但尚要進(jìn)行一些特殊處理。第45頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五四、常用的免疫酶標(biāo)記技術(shù)(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)2、染色方法:可采用直接法、間接法、抗抗體搭橋法、雜交抗體法、酶抗酶復(fù)合物法、增效抗體法等各種染色方法，其中直接法和間接法最常用。反應(yīng)中每加一種反應(yīng)試劑，均需于37℃作用30min，然后以PBS反復(fù)洗滌3次，以除去未結(jié)合物。第46頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(1)直接法以酶標(biāo)抗體處理標(biāo)本，然后浸于含有相應(yīng)底物和顯色劑的反應(yīng)液中，通過(guò)顯色反應(yīng)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物的存在。(2)間接法標(biāo)本用相應(yīng)的特異性抗體處理后，再加酶標(biāo)記的抗抗體，然后經(jīng)顯色揭示抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物的存在。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第47頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(3)抗抗體搭橋法

是利用抗抗體既能與反應(yīng)系統(tǒng)的抗體結(jié)合，又能與抗酶抗體結(jié)合(抗酶抗體與針對(duì)抗原的抗體必須是同源的)的特性，以抗抗體作橋連接抗體和抗酶抗體。先加抗體(如兔抗血清)使與標(biāo)本上的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加抗抗體(羊抗兔血清)與抗體結(jié)合，再加既能與抗抗體結(jié)合又能與酶結(jié)合的兔抗酶抗體，最后用底物顯色。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第48頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(3)抗抗體搭橋法此法的優(yōu)點(diǎn)在于：克服了因酶與抗體交聯(lián)引起的抗體失活和標(biāo)記抗體與非標(biāo)記抗體對(duì)抗原的競(jìng)爭(zhēng)，從而提高了敏感性；但抗酶抗體與酶之間的結(jié)合多為低親和性，沖洗標(biāo)本時(shí)易被洗脫，使敏感性降低。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第49頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(4)酶抗酶復(fù)合物法：亦稱(chēng)PAP法。此法是將HRP和抗HRP抗體結(jié)合形成酶抗酶抗體復(fù)合物(PAP)，用PAP來(lái)代替抗抗體搭橋法中的抗酶抗體和酶。其敏感性較搭橋法高。本法亦可用于ELISA。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第50頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(5)雜交抗體法：將特異性抗體分子與抗酶抗體分子經(jīng)胰酶消化成雙價(jià)F(ab)2片段，將這兩種抗體的F(ab)2片段按適當(dāng)?shù)谋壤旌?，在低濃度的乙酰乙胺和充氮條件下，使之進(jìn)一步裂解為單價(jià)Fab片段，再在含氮條件下使其還原復(fù)合。經(jīng)分子篩層析后，即可獲得25％～50％的雜交抗體。這種雜交抗體分子含有兩個(gè)抗原結(jié)合部位：一邊能與特異性抗原結(jié)合；另一邊能與酶結(jié)合。因此，不必事先制備標(biāo)記抗體。檢測(cè)標(biāo)本直接用雜交抗體和酶處理，即可浸入底物溶液中，進(jìn)行顯色反應(yīng)。雜交抗體還可采用雜交瘤技術(shù)和基因工程抗體技術(shù)進(jìn)行制備。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第51頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(6)增效抗體法：同時(shí)使用酶標(biāo)抗體與抗酶抗體，其程序?yàn)椋嚎乖?、酶?biāo)記抗體、抗抗體、抗酶抗體、酶、底物。此法能使更多的酶連接在抗原上，從而使顯色反應(yīng)增強(qiáng)，提高其敏感性。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第52頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3、顯色反應(yīng)免疫酶組化染色中的最后一環(huán)是用相應(yīng)的底物使反應(yīng)顯色。不同的酶所用底物和供氫體不同。同一種酶和底物如用不同的供氫體，則其反應(yīng)物的顏色也不同。如辣根過(guò)氧化物酶，在組化染色中最常用DAB，用前應(yīng)以0．05mol／LpH7．4～7．6的Tris-HCl緩沖液配成50～75mg／100mL溶液，并加少量(0．01％～0．03％)H202混勻后加于反應(yīng)物中置室溫10～30min，反應(yīng)產(chǎn)物呈深棕色；如用甲萘酚，則反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色；用4-氯-1-萘酚，則呈淺藍(lán)色或藍(lán)色。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第53頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4、標(biāo)本觀察顯色后的標(biāo)本可在普通顯微鏡下觀察，抗原所在部位呈色。亦可用常規(guī)染料作反襯染色，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為清晰，有利于抗原的定位。本法優(yōu)于免疫熒光抗體技術(shù)之處，在于毋須應(yīng)用熒光顯微鏡，且標(biāo)本可以長(zhǎng)期保存。(一)免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)第54頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(二)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)，ELISA是應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項(xiàng)新技術(shù)。其基本過(guò)程是將抗原(或抗體)吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。第55頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第56頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法：用特異性抗體包被固相載體，加入含待測(cè)抗原的溶液和一定量的酶標(biāo)記抗原共同孵育，對(duì)照僅加酶標(biāo)抗原，洗滌后加入酶底物。被結(jié)合的酶標(biāo)記抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定。如待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的酶標(biāo)記抗原的量越少，顯色就越淺?？捎貌煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行反應(yīng)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD值求出檢測(cè)樣品中抗原的含量。第57頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗體稀釋及加樣方法500l樣品稀釋液女女500lE-Ab陰原1:21:41:81:161:321:64空第2列：陰性對(duì)照（Ag+/Ab-）第10列：空白對(duì)照（Ag-/Ab-）

1.準(zhǔn)備6個(gè)稀釋管，做好標(biāo)記。2.先在每個(gè)稀釋管中加入稀釋液500ul。3.取出500ul抗體加入第一管，混勻后，取出500ul加入第二管，依此類(lèi)推至最后管。第58頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五封閉的作用包被時(shí)所用的抗原或抗體濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而防止非特異性吸附，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。如圖：第59頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五TMB（四甲基聯(lián)苯胺）TMB經(jīng)HRP作用后其產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，產(chǎn)物由藍(lán)色變成黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為405nm。TMB有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。第60頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五固相載體有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。用聚苯乙烯微量滴定板(40孔或96孔板)是目前最常用的載體，小孔呈凹形，操作簡(jiǎn)便，有利于大批樣品的檢測(cè)。新板在應(yīng)用前一般無(wú)需特殊處理，直接使用或用蒸餾水沖洗干凈，自然干燥后備用。一般均一次性使用，如用已用過(guò)的微量滴定板，需進(jìn)行特殊處理。第61頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五結(jié)果判定ELISA試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察，也可用ELISA測(cè)定儀測(cè)定樣本的光密度(0D)值。每次試驗(yàn)都需設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，肉眼觀察時(shí)，如樣本顏色反應(yīng)超過(guò)陰性對(duì)照，即判為陽(yáng)性。用ELISA測(cè)定儀來(lái)測(cè)定OD值，所用波長(zhǎng)隨底物供氫體不同而異，如以O(shè)PD為供氫體，測(cè)定波長(zhǎng)為492nm，TMB為650nm(氰氟酸終止)或450nm(硫酸終止)。第62頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五(三)斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)，此法的原理及其步驟與ELISA基本相同，不同之處在于：一是將固相載體以硝酸纖維素濾膜、硝酸醋酸混合纖維素濾膜、重氮芐氧甲基化紙等固相化基質(zhì)膜代替，用以吸附抗原或抗體；二是顯色底物的供氫體為不溶性的。結(jié)果以在基質(zhì)膜上出現(xiàn)有色斑點(diǎn)來(lái)判定?？刹捎弥苯臃ā㈤g接法、雙抗體法、雙夾心法等。第63頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第64頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第65頁(yè)，共74頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、原理放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是將放射性同位素測(cè)量的高度敏感性和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性結(jié)合起來(lái)而建立的一種免疫分析技術(shù)。1959年，Yalow和Berson共同建立了放射免疫分析，由于這種檢測(cè)方法可以精確地測(cè)定體液中的微量活性物質(zhì)，是免疫定量分析技術(shù)的一次重大突破和飛躍，因而