免疫組織 細(xì)胞培養(yǎng)課件2018

細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程CellCultureandTissueEngineering張標(biāo)副教授廣東醫(yī)科大學(xué)組胚教研室JamesPAlisonTasukuHonjo2018諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎得主免疫療法抗腫瘤的機(jī)制PD1與PD-L1抑制劑抗腫瘤原理第四章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CellCultureTechniquePubMed上檢索細(xì)胞培養(yǎng)的論文數(shù)1905-2019“cellculture”第四章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、培養(yǎng)細(xì)胞生長的基本條件與特性二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備和準(zhǔn)備工作三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)概述—細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用廣泛細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)、組織工程學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。概述—什么是細(xì)胞培養(yǎng)？

體外培養(yǎng)：是在無菌條件下，取出活體細(xì)胞、組織或器官，置于類似體內(nèi)生存的生理環(huán)境中，使其生長、增殖并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。體外培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)組織培養(yǎng)(tissueculture)器官培養(yǎng)(organculture)(Invitro)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)：離散細(xì)胞（包括單個細(xì)胞）在體外培養(yǎng)。組織培養(yǎng)(tissueCulture)：組織塊的培養(yǎng)(細(xì)胞不離散)或體外培養(yǎng)的細(xì)胞群聚集并重建三維組織結(jié)構(gòu)的體外培養(yǎng)。器官培養(yǎng)(organCulture)：體內(nèi)器官原基、整體或局部，保持原有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的體外培養(yǎng)。概述—各類體外培養(yǎng)的特點概述—細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點實時性：能長時間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。2.可控性：

對象：均一性、重復(fù)性

類型：上皮？間質(zhì)？

性質(zhì)：正常？腫瘤？

條件：物理、化學(xué)、生物等因素可控

方法：采用各種研究技術(shù)、記錄方法可控優(yōu)點：概述—細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點優(yōu)點：3.應(yīng)用廣：學(xué)科多，對象廣。4.較經(jīng)濟(jì)：可提供大量、重復(fù)性好、生物學(xué)性狀相似的實驗對象概述—細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點缺點：1.與體內(nèi)主要不同缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間正常的相互作用。2.主要表現(xiàn)與體內(nèi)不同失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，細(xì)胞趨向單一化。實驗結(jié)果的解釋要謹(jǐn)慎！三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（一）基本操作和要求1.培養(yǎng)前準(zhǔn)備2.培養(yǎng)室和超凈工作臺的消毒3.洗手和著裝4.無菌培養(yǎng)操作5.安全操作(無菌操作)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)細(xì)菌污染酵母污染霉菌污染支原體污染三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（二）原代培養(yǎng)組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。

1.組織塊培養(yǎng)法

2.消化培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)法三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)2.消化培養(yǎng)法

恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)rMSC的形態(tài)學(xué)觀察ABCD貼壁篩選法密度梯度離心法96h8d（三）傳代培養(yǎng)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)吸除培養(yǎng)液消化前細(xì)胞加消化液消化后細(xì)胞吸除消化液加培養(yǎng)液終止消化吹打制成細(xì)胞懸液計數(shù)接種（三）傳代培養(yǎng)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（四）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

保存細(xì)胞系或細(xì)胞株，是細(xì)胞培養(yǎng)中的重要工作。細(xì)胞可永久儲存在液氮中(-196℃)。基本原則：慢凍快融，這樣可以最大限度地減少細(xì)胞在凍存和復(fù)蘇過程中的損害，保存細(xì)胞活力。細(xì)胞的凍存：保護(hù)劑：二甲基亞砜(DMSO)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)方法與過程：（1）選擇指數(shù)生長期的細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。（2）配制含10%DMSO的凍存培養(yǎng)液。（3）消化細(xì)胞，用凍存培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，移入凍存管并作好標(biāo)記。（4）將凍存管放入4℃冰箱，約40min。（5）將凍存管置于-20℃冰箱，約30~60min。（6）將凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜。（7）將凍存管置于-196℃液氮罐中長期保存。2.細(xì)胞的復(fù)蘇：快速融化。（1）將水浴鍋預(yù)熱至37℃。（2）從液氮罐中取出凍存管。迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍（3）約1~2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解。取出凍存管，以1000rpm離心3min。（4）用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，放入超凈臺內(nèi)。（5）吸棄上清液，向離心管內(nèi)加入培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)。接種密度以5×105/ml為宜。（6）將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況及時換液傳代。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)實驗技術(shù)相關(guān)的網(wǎng)站/index.htm

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http://www.nibsc.ac.uk//

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http://www.stemcellnetwork.ca/

//實驗中的組織工程耳第五章組織工程

TissueEngineering一、組織工程的發(fā)展背景移植器官來源嚴(yán)重缺乏

1980’sJosephVacanti及RobertLanger結(jié)合醫(yī)學(xué)及工程材料背景，研發(fā)能修復(fù)人體病變組織與器官之治療方式

1990年舉辦第一屆組織工程學(xué)術(shù)研討會，1995年發(fā)行專業(yè)期刊

TissueEngineering

人造組織目前發(fā)展方向：皮膚、神經(jīng)、肌肉骨骼系統(tǒng)(骨,軟骨,肌肉)、心血管系統(tǒng)(血管,心瓣膜)、內(nèi)分泌器官(肝,胰,腎...)1.Theuseofacombinationofcells,engineeringmaterials,andsuitablebiochemicalfactorstoimproveorreplacebiologicalfunctions.2.Aninterdisciplinaryfieldofresearchthatappliesboththeprinciplesofengineeringandtheprocessesandphenomenaofthelifesciencestowardthedevelopmentofbiologicalsubstitutesthatrestore,maintain,orimprovetissuefunction(LangerandVacanti,1993).WhatisTissueEngineering?組織工程的基本概念

應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原則和方法，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興科學(xué)。它是在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、大規(guī)模細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)、新型醫(yī)學(xué)材料、體外組織構(gòu)建技術(shù)、移植免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科迅速發(fā)展以后創(chuàng)建的邊緣學(xué)科。PubMed上檢索再生醫(yī)學(xué)、組織工程論文數(shù)“tissueengineering”1942-20191920-2019“regenerativemedicine”Regenerativemedicinereferstobothcelltherapyandtissueengineering.Celltherapyutilizesnewcellstoreplacedamagedcellswithinatissuetorestoreitsintegrityandfunction.Tissueengineeringencompassesthreeapproaches:theuseofbioactivemoleculessuchasgrowthfactorsthatencouragetissueinduction;theuseofcellsthatrespondtovarioussignals;andtheseedingofcellsintothree-dimensionalmatricestocreatetissue-likeconstructstoreplacethelostpartsoftissuesororgans(Howardetal.,2008).WhatisRegenerativeMedicine?二、組織工程基本方法A獲取組織B分離、培養(yǎng)種子細(xì)胞C制備三維支架D將種子細(xì)胞種植于支架E將細(xì)胞-支架復(fù)合物植入組織缺損處組織工程基本方法示意圖是將獲得的種子細(xì)胞進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)增殖，誘導(dǎo)分化，或經(jīng)適當(dāng)?shù)幕蛐揎椇?，接種在可降解的三維支架材料上于體外聯(lián)合培養(yǎng)，構(gòu)建成具有三維有序結(jié)構(gòu)、其各種特性與相應(yīng)組織相容的活的組織塊，然后植入體內(nèi)，替代病損組織器官的部分或全部功能。組織工程研究目標(biāo)是以最短的時間，使組織、器官的損傷得到最佳的修復(fù)，即完全再生性愈合。組織工程基本方法三、組織工程三要素組織工程三要素1.種子細(xì)胞2.具有生物活性（可降解）的三維支架材料3.各種細(xì)胞因子以促進(jìn)細(xì)胞移行、增殖、分化

和有序排列。1．種子細(xì)胞理想種子細(xì)胞的要求來源廣，數(shù)量充足易培養(yǎng)，粘附力大，增殖強(qiáng)，可大量擴(kuò)增遺傳背景穩(wěn)定，純度高。有特定生物學(xué)功能免疫排斥反應(yīng)極小或無反應(yīng)結(jié)構(gòu)和功能與再生組織的正常細(xì)胞相似臨床上易取得，供體損傷小，具有實用性組織工程研究的核心內(nèi)容來源異種：動物細(xì)胞同種異體：其他人細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞自體：體細(xì)胞、成體干細(xì)胞、iPS1．種子細(xì)胞成體干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）山中伸彌ShinyaYamanaka諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎（2012）“小保方晴子”事件

生物活性材料的設(shè)計是工程化地構(gòu)建與細(xì)胞外基質(zhì)相類似的支架材料，使其分子構(gòu)成能滿足種子細(xì)胞在理化性質(zhì)上的要求以及組織的生理學(xué)要求。2.組織工程支架材料理想的組織工程支架材料：①良好的生物組織相容性。②良好的生物降解性。③具有理想三維立體孔隙和滲透性。④具有可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度。⑤具有良好的材料—細(xì)胞界面。2.組織工程支架材料聚合物材料：聚乳酸、聚乙醇酸及二者共聚物陶瓷材料：羥基磷灰石、磷酸鈣水泥、生物玻璃天然材料：膠原、透明質(zhì)酸、甲殼素、珊瑚復(fù)合材料：磷酸鈣+聚乳酸；納米材料脫細(xì)胞材料：骨、肌腱、真皮、膀胱、軟骨智能材料：聚異丙基丙烯酰胺支架材料scaffordmaterial支架材料scaffordmaterial

研究不同生長因子對不同來源的種子細(xì)胞移行、增殖、分化和有序排列及其與生物活性材料相容生長是一個復(fù)雜而極具挑戰(zhàn)的工作。BMP促進(jìn)成骨VEGF、PDGF促進(jìn)血管化IGF、bFGF促進(jìn)分化NGF促進(jìn)神經(jīng)再生3.生長調(diào)節(jié)因子

RA胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－神經(jīng)細(xì)胞

DMSO胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－肌肉細(xì)胞

TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－血管和內(nèi)皮細(xì)胞

RA+胰島素+T3胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－脂肪細(xì)胞

BMP-2,BMP-4胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－軟骨細(xì)胞

地塞米松，磷酸甘油胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－骨細(xì)胞

bFGF,煙酰胺胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－胰島樣細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)分化因子以材料工程的眼光，除了以上三種基本要素外，以下三個課題是研究開始進(jìn)行時所必須考量的：如何更精確的控制組織生長支架的降解與支撐強(qiáng)度間之關(guān)系?如何引導(dǎo)細(xì)胞向支架內(nèi)部及頂端生長?如何增加細(xì)胞的生長效率?4.組織工程其他要素解決方案：以非均質(zhì)性支架，控制不同時期的降解速率。以超音波或電磁場等物理源，配合支架中添加細(xì)胞粘附蛋白，促進(jìn)細(xì)胞增生及導(dǎo)引細(xì)胞生長方向。以循環(huán)生物反應(yīng)器(bioreactor)做為組織工程培養(yǎng)系統(tǒng)。4.組織工程其他要素釋放載體智能化—生長因子釋放載體將VEGF載在PLGA多孔支架內(nèi)，而PDGF預(yù)先用PLGA包裹，再與支架復(fù)合形成雙重生長因子釋放體系。此類支架在開始的7天以1.7pmol/d的劑量在體外釋放VEGF，而后以0.1-4.2pmol/d的劑量釋放PDGF，可由PLGA的組成和分子量進(jìn)行調(diào)控。VEGF是血管新生的起始因子。PDGP能促進(jìn)血管成熟。3D生物打印機(jī)光固化成型激光打印噴墨打印microextrusion打印機(jī)有兩個噴頭，一個噴涂細(xì)胞（黃色），另一個噴涂水溶膠（紅色）以支持和固定細(xì)胞，待細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)固后可以將水溶膠移除打印機(jī)的噴頭及其作用器官打印的過程三維生物打印機(jī)的原型機(jī)，技術(shù)人員正在試驗打印程序一、計算機(jī)輔助設(shè)計出該器官的結(jié)構(gòu)藍(lán)圖二、將所需細(xì)胞精確“打印”到位三、后期處理促進(jìn)細(xì)胞融合和器官成熟技術(shù)步驟3DPrintingofOrgans-On-Chips肢體臟器量販店給我來顆心！路線一：功能細(xì)胞+支架材料→體外培養(yǎng)→成熟生物組織→植入體內(nèi)路線二：功能細(xì)胞+支架材料→體外短期培養(yǎng)→植入體內(nèi)，逐漸發(fā)育成形四、組織工程路線圖舉例：組織工程與心肌梗死1.種子細(xì)胞與心肌梗死1.種子細(xì)胞與心肌梗死1.種子細(xì)胞與心肌梗死1.種子細(xì)胞與心