實驗動物學課79

實驗動物學課79第1頁/共76頁第七章人類疾病的動物模型主要介紹了人類疾病動物模型概念、復(fù)制模型的意義和原則；常用疾病模型的復(fù)制方法和應(yīng)用；免疫缺陷動物、轉(zhuǎn)基因動物定義及其在生命科學研究中的應(yīng)用。研究動物模型目的在于揭示人類疾病發(fā)病機理，尋找預(yù)防疾病的有效措施。第2頁/共76頁第一節(jié)動物模型概述人類疾病動物模型:（AnimalModelofHumanDiseases）

是指醫(yī)學研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物實驗對象和相關(guān)材料。動物模型的研究，實質(zhì)上是有關(guān)實驗動物的應(yīng)用科學。動物模型主要用于實驗生理學、實驗病理學和實驗治療學（藥物篩選和新疫苗開發(fā)）。第3頁/共76頁一、人類疾病動物模型的意義避免人體實驗造成的危害可復(fù)制不易見到的疾病可復(fù)制發(fā)病率低、潛伏期和病程長的疾病嚴格控制試驗條件，增加實驗的可比性樣品易得，實驗操作簡化有助于全面認識疾病本質(zhì)第4頁/共76頁二、人類疾病動物模型的復(fù)制原則相似性重復(fù)性可靠性適用性和可控性易行性和經(jīng)濟性第5頁/共76頁三、人類疾病動物模型的分類（一）按產(chǎn)生原因分類

1．實驗性動物摸型（ExperimentalAnimalModel）

又稱誘發(fā)性動物模型

是指研究者通過使用物理性、化學性、生物性和復(fù)合性致病因素作用于動物，造成動物組織、器官或全身特定的損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時的功能、代謝或形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的病變，即人為地誘發(fā)動物產(chǎn)生類似人類疾病模型。

第6頁/共76頁2．自發(fā)性動物模型（SpontaneousAnimalModel）

是指實驗動物未經(jīng)任何人工處置，動物自然發(fā)生的疾病，或由于基因突變，通過遺傳育種保留下來的動物模型。主要包括突變系的遺傳疾病模型和近交系的腫瘤疾病模型。第7頁/共76頁3．抗疾病型動物模型（NegativeAnimalModel）

是指特定的疾病不會在某種動物身上發(fā)生，從而可以用來探討為何這種動物對該疾病有天然的抵抗力。如哺乳動物均易感染血吸蟲病，而居于洞庭湖流域的東方田鼠卻不能復(fù)制血吸蟲病。第8頁/共76頁4．生物醫(yī)學動物模型（BiomedicalAnimalModel）是指利用健康動物生物學特征來提供人類疾病相似表現(xiàn)的疾病模型。

兔甲狀旁腺分布比較分散，位置不固定，有的附著在主動脈弓附近，摘除甲狀腺不影響甲狀旁腺功能，是摘除甲狀腺實驗較理想的動物模型第9頁/共76頁（二）按系統(tǒng)范圍分類1．疾病的基本病理過程動物模型AnimalModelofFundamentalPathologicProcessesofDisease是指各種疾病共有的一些基本病理過程模型。2．系統(tǒng)疾病動物模型AnimalModelofDifferentSystemDiseases是指與人類各系統(tǒng)疾病相應(yīng)的動物模型，如消化、呼吸、泌尿、心血管、神經(jīng)等系統(tǒng)疾病相應(yīng)的動物模型。第10頁/共76頁（三）按模型種類分類疾病模型的種類包括整體動物、離體器官和組織、細胞株和數(shù)字模型。整體動物模型是常用的疾病模型，也是研究人類疾病常用的手段。第11頁/共76頁四、影響動物模型質(zhì)量的因素致模因素動物因素實驗技術(shù)因素1．實驗季節(jié)2．晝夜不同時間的影響3．麻醉深度的影響4．操作技術(shù)的5．實驗給藥的影響6．對照組對造模的影響環(huán)境因素和營養(yǎng)因素第12頁/共76頁第二節(jié)常用動物模型的復(fù)制一、腫瘤動物模型

自發(fā)性動物腫瘤模型誘發(fā)性腫瘤動物模型1.肝癌二乙基亞硝胺（DEN）誘發(fā)大鼠肝癌，雌雄不限。亞胺基偶氮甲苯（OAAT）誘發(fā)小鼠肝癌黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌

2.胃癌甲基芐基亞硝胺（MBNA）復(fù)制小鼠前胃癌3.肺癌二乙基亞硝胺（DEN）誘發(fā)小鼠肺癌

移植性腫瘤動物模型第13頁/共76頁二、消化系統(tǒng)疾病動物模型

幽門螺桿菌感染動物模型肝硬化動物模型胃腸漬瘍動物模型三、呼吸系統(tǒng)疾病動物模型

慢性支氣管炎動物模型支氣管哮喘動物模型急性呼吸窘迫綜合征動物模型第14頁/共76頁四、心血管系統(tǒng)疾病動物模型動脈粥樣硬化高血壓動物模型五、內(nèi)分泌及營養(yǎng)代謝性疾病動物模型

糖尿病動物模型營養(yǎng)性肥胖動物模型第15頁/共76頁六、傳染性疾病動物摸型病毒性肝炎動物模型流行性出血熱動物模型七、生殖醫(yī)學動物模型

致畸試驗動物模型前列腺增生癥病理實驗動物模型第16頁/共76頁第三節(jié)免疫缺陷動物免疫缺陷動物(immunodeficientanimal)是指由于先天性遺傳突變或用人工誘導(dǎo)的方法建立的一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動物。第17頁/共76頁一、免疫缺陷動物的分類1先天性免疫缺陷動物：

a.T淋巴細胞功能缺陷動物：裸小鼠，裸大鼠

b.B淋巴細胞功能缺陷動物：CBA/N小鼠

c.NK細胞功能缺陷動物：Beige小鼠

d.聯(lián)合免疫缺陷動物：SCID小鼠等2獲得性免疫缺陷動物：猴、小鼠、貓等AIDS模型第18頁/共76頁二、免疫缺陷動物的特征及其應(yīng)用1．裸小鼠(nudemice)(1)發(fā)現(xiàn)與培育：裸鼠(nu/nu)1962年由英國格拉斯哥醫(yī)院的Grist在非近交系小鼠培育中偶爾發(fā)現(xiàn)無毛小鼠。1966年經(jīng)英國愛丁堡研究所的Flanagan證實，這種小鼠是由于11號染色體上的等位基因發(fā)生突變所致。1968年P(guān)antelouris研究發(fā)現(xiàn)該無毛小鼠沒有胸腺。1969年Rygaard首先將人結(jié)腸腺癌移植裸小鼠獲得成功第19頁/共76頁(2)裸小鼠的主要缺陷特征：①被毛生長發(fā)育異常，表現(xiàn)為全身形似無毛，呈裸體狀；②無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常的上皮細胞，這種上皮細胞不能使T細胞正常的分化，因而免疫力低下；③細胞正常，成年裸小鼠的NK細胞活性較高，但幼鼠的NK細胞活性相對低下。第20頁/共76頁(3)裸小鼠在生物醫(yī)學研究中的應(yīng)用：①在組織移植(人類腫瘤)研究方面②在腫瘤藥物治療和腫瘤免疫研究方面③免疫和遺傳研究方面④病毒、細菌、寄生蟲感染機制的研究方面⑤其他方面的研究第21頁/共76頁2．裸大鼠(nuderat)

(1)裸大鼠的發(fā)現(xiàn)與培育：1953年由英國的阿伯丁研究所發(fā)現(xiàn)，基因符號為rnu；1975年又發(fā)現(xiàn)了純合子的裸大鼠(nu／nu)，1977年在英國的MRC實驗動物中心建立了裸大鼠種群。此后逐步引入美國、日本等。1983年引人中國。第22頁/共76頁(2)裸大鼠的一般特征：①體毛稀少，裸大鼠并不像裸小鼠一樣完全無毛，而是體毛稀少，尾根往往多毛；②發(fā)育遲緩與裸小鼠一樣發(fā)育相對較緩慢，體重為正常大鼠的70％左右；③繁育能力差，由于裸大鼠與裸小鼠一樣在妊娠期間乳腺發(fā)育缺損，故其繁殖方式同裸小鼠相同，即用純合子的雄鼠與雜合子的雌鼠交配方式進行繁育；④易患呼吸道疾病，由于其無胸腺，免疫力低下，因此易感各種疾病，特別是在環(huán)境較差時，易感潰瘍性氣管炎和化膿性支氣管炎等，生存時間約6～7個月。第23頁/共76頁(3)裸大鼠的免疫缺陷特征：①免疫器官的組織學與裸小鼠相似，幼齡裸大鼠的解剖發(fā)現(xiàn)，有胸腺殘跡，內(nèi)有未分化的上皮細胞，但未見淋巴細胞；②先天性無胸腺，無T細胞，T細胞功能缺失，但B細胞功能正常，NK細胞的活力較正常鼠高。第24頁/共76頁(4)裸大鼠在生物醫(yī)學上的應(yīng)用：主要用于人體腫瘤的移植研究。進行外科手術(shù)，為各部位腫瘤移植和腫瘤供血研究提供了方便。第25頁/共76頁（二）B淋巴細胞缺陷動物又稱為性連鎖免疫缺陷小鼠（X-LinkedImmuneDeficiencyMice，XID）

起源于CBA／N品系，其B細胞功能缺陷，基因xid，位于X性染色體上。純合子雌鼠（xid／xid）和雜合子雄鼠（xid／Y）對非胸腺依賴Ⅱ型抗原沒有體液免疫反應(yīng)，血清中IgM和IgG含量降低，對B細胞分裂素缺乏反應(yīng)，B細胞數(shù)量減少，T細胞功能正常。其病理與人類Bruton丙種球蛋白缺乏癥和Wziskott-Aidsch綜合征相似。第26頁/共76頁（三）NK細胞缺陷Beige小鼠（四）嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠

第27頁/共76頁第四節(jié)轉(zhuǎn)基因動物

一、轉(zhuǎn)基因動物的概念轉(zhuǎn)基因動物是指基因組中穩(wěn)定地整合有以實驗方法所導(dǎo)入的外源基因或特定DNA片段的動物。嵌合體動物（chimericanimal）：只有部分組織細胞的基因組中整合有外源基因。

逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細胞介導(dǎo)法制備的動物第一代均為嵌合體。雄原核顯微注射法制備的動物第一代中1-10%為嵌合體（延遲整合）。第28頁/共76頁二、轉(zhuǎn)基因動物的原理方法第29頁/共76頁轉(zhuǎn)基因動物的制作方法1、受精卵雄原核顯微注射法2、胚胎干細胞（ES細胞）法3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4、體細胞核移植法5、精子載體法6、YAC法（YAC：酵母人工染色體）第30頁/共76頁三、轉(zhuǎn)基因動物的制備實驗程序如下：（1）準備假孕母鼠（養(yǎng)母）（2）受精卵的準備（3）基因?qū)耄?）胚胎移植（5）對幼鼠的鑒定第31頁/共76頁人類已獲得轉(zhuǎn)基因魚、鼠、羊、豬、兔、牛等等大小動物。第32頁/共76頁四、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用1、動物乳腺生物反應(yīng)器

1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α-抗胰蛋白酶，含量高達30毫克/升。

“生物反應(yīng)器”的概念也由此產(chǎn)生。第33頁/共76頁目前已在下列動物的乳汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥物：牛：抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、乳鐵蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等；山羊：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、組織纖溶原激活因子、單克隆抗體等；綿羊：抗胰蛋白酶、凝血因子Ⅸ、蛋白C；豬：凝血因子Ⅸ、蛋白C、纖維蛋白原、血紅蛋白。第34頁/共76頁2、建立疾病模型，用于疾病研究和藥物篩選等目前已建立的疾病模型有：癌癥、動脈粥樣硬化、鐮狀細胞性貧血、囊狀纖維化、紅細胞增多癥、肝炎、免疫缺陷、自發(fā)性高血壓等。3、用于育種，提高育種效率轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于育種，不僅可以加快改良遺傳性狀的進程，使選擇的效率提高，改良的機會更多，而且不會受到有性繁殖的局限。第35頁/共76頁目前轉(zhuǎn)基因動物研究領(lǐng)域尚存在：1）制備的效率低制備一只轉(zhuǎn)基因小鼠，需40個注射過的受精卵，而綿羊、山羊、豬、牛分別為110、90、110和1600。而轉(zhuǎn)基因個體的后代中只有50%表達基因）2）轉(zhuǎn)入的基因不能表達或表達混亂3）不能遺傳給后代等。第36頁/共76頁第五節(jié)胚胎工程技術(shù)胚胎工程技術(shù)主要是指從雌、雄生殖細胞至囊胚的體外操作技術(shù)，包括人工授精、同期發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎培養(yǎng)、胚胎保存、胚胎移植、胚胎分割、胚胎嵌合、體外授精、顯微授精、性別控制、基因轉(zhuǎn)移、胚胎干細胞、細胞核移植、卵母細胞激活與孤雌發(fā)育等等。第37頁/共76頁(一)胚胎分割用顯微術(shù)將未著床的早期胚胎一分為二，四或更多，然后分別移植給受體，妊娠產(chǎn)仔。一枚胚胎可克隆出兩個或兩個以上的后代。Mular等于1968年將兔的2～8細胞期胚胎一分為二，移植給受體獲得成功。70年代，利用胚胎分割先后得到小鼠、牛、山羊、馬和豬的同胚雙生后代。1986年，西北農(nóng)業(yè)大學張涌、竇忠英等分別獲得胚胎二分割的同胚雙鼠和半胚犢牛。1987年，譚麗玲等，奶牛，張涌等，山羊獲得同胎雙生后代。1988年，杜森等，獲得同胚雙生后代兔。1992年，徐寧等得同胚三鼠6組。1996年陶濤等得胚胎單細胞(分裂球)移植仔豬。目前，小鼠、家兔、山羊、綿羊、豬等實驗動物均可用胚胎分割技術(shù)獲得同卵孿生后代。第38頁/共76頁(二)胚胎嵌合將兩枚或多枚胚胎細胞聚合共同發(fā)育成一個胚胎，稱為嵌合體(chimera)。兩種以上不同基因型(如A和B)的變精卵，復(fù)合而發(fā)育成的個體也稱為嵌合體，又稱異表型體(allophenics)。小鼠、大鼠、兔、牛、豬、山羊嵌合體以及大鼠小鼠、綿羊-山羊、馬-斑馬和牛-水牛等屬間嵌合體第39頁/共76頁嵌合體小鼠第40頁/共76頁(三)胚胎干細胞胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES)來源于胚胎的內(nèi)細胞團(innercellmass，ICM)和原始生殖細胞(primordialgerm，PGC),具有發(fā)育全能性(具有分化發(fā)育成三個胚層細胞的潛力)的細胞,是動物多種組織細胞的祖細胞。能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。

第41頁/共76頁（四）細胞核移植第42頁/共76頁（五）卵母細胞激活與孤雌發(fā)育第43頁/共76頁思考題：1、什么是疾病動物模型？2、使用人類疾病動物模型的意義？3、免疫缺陷動物？祼小鼠、裸大鼠的生物學特性？4、轉(zhuǎn)基因動物、原理、方法和應(yīng)用？5、胚胎工程技術(shù)包括哪些？6、什么是ES細胞？第44頁/共76頁第八章動物實驗技術(shù)第45頁/共76頁第一節(jié)實驗動物的選擇基本原則實驗動物的選擇是動物實驗研究中首要考慮的問題之一，不同實驗的研究目的和要求不同，不同種類實驗動物也有其各自的生物學特點和解剖生理特征。第46頁/共76頁選擇動物應(yīng)遵循的原則是：一、相似性原則是指利用動物與人類某些機能、代謝、結(jié)構(gòu)及疾病特點的相似性選擇實驗動物。

組織結(jié)構(gòu)方面系統(tǒng)機能方面生理特性方面繁殖特性方面體液成分方面解剖特性方面1．骨骼構(gòu)成2．臟器構(gòu)成3．臟器形態(tài)

疾病特點方面第47頁/共76頁二、特殊性原則是指利用不同種系的實驗動物機體存在的特殊構(gòu)造或某些特殊反應(yīng)選擇解剖、生理特點符合實驗?zāi)康暮鸵蟮膭游?。保證實驗成功的關(guān)鍵減少實驗準備方面的麻煩降低操作難度第48頁/共76頁三、標準化原則是指動物實驗中選擇和使用與研究內(nèi)容相匹配的標準化的實驗動物。遺傳學微生物學環(huán)境營養(yǎng)控制第49頁/共76頁四、規(guī)格化原則是指選擇與實驗要求一致的動物規(guī)格。動物的種類及品系動物的年齡體重性別生理及健康狀況等。第50頁/共76頁1歲的犬對應(yīng)人的年齡約為15歲；2歲的犬對應(yīng)人的年齡約為24歲；5歲的犬對應(yīng)人的年齡約為36歲；8歲的犬對應(yīng)人的年齡約為48歲；10歲的犬對應(yīng)人的年齡約為56歲；12歲的犬對應(yīng)人的年齡約為64歲；14歲的犬對應(yīng)人的年齡約為72歲；16歲的犬對應(yīng)人的年齡約為80歲。第51頁/共76頁五、經(jīng)濟性原則是指盡量選用容易獲得、價格便宜和飼養(yǎng)經(jīng)濟的動物。第52頁/共76頁在具體實際工作中：首先必須了解實驗動物生物學特性方面的基本知識，為正確選擇合適的動物打下基礎(chǔ)。其次，還應(yīng)充分查閱相關(guān)文獻，利用前人的實踐經(jīng)驗積累，選擇科研、檢驗和生產(chǎn)傳統(tǒng)上應(yīng)用的實驗動物。同時，加強與實驗動物科學工作者的交流，及時有效地利用實驗動物學的最新成果。則可用較少的人力、動物和時間，以最小的代價最大限度地獲得科學性強的實驗結(jié)果。第53頁/共76頁第二節(jié)常見動物實驗中實驗動物的選擇藥理學研究中的選擇毒理研究中的選擇心血管系統(tǒng)免疫學傳染病學寄生蟲病學環(huán)境科學畜牧獸醫(yī)學第54頁/共76頁第三節(jié)動物實驗前的準備準備工作的內(nèi)容有：飼養(yǎng)室和飼養(yǎng)器具的準備動物數(shù)目的確定動物的購入動物的稱重動物的分組標記及動物的管理等。第55頁/共76頁動物的購入時注意事項1．各項實驗前的準備工作是否已落實，如動物籠具數(shù)量、清潔衛(wèi)生情況、動物觀察室內(nèi)是否已消毒。2．購入動物時應(yīng)向供應(yīng)部門索取動物的遺傳背景資料、實驗動物有效的質(zhì)量合格證、實驗動物微生物控制的檢查資料以及動物的年齡和健康等方面的資料。第56頁/共76頁3．如若是清潔級以上級別的動物，其運輸工具應(yīng)嚴格檢查密封狀況。購入動物回到實驗室的時間不宜太長。如若是長途運輸，還應(yīng)考慮到途中各種因素對動物的影響，如運輸環(huán)境的溫度、濕度、飲食等等。尤其要注意動物在途中不能被污染和引起窒息死亡。第57頁/共76頁4．動物健康檢查：應(yīng)對購入動物的健康情況進行詳細檢查，檢查包括：（1）外觀。一般常發(fā)生異常的部位及其外觀檢查內(nèi)容有：皮毛：有無光澤和脫毛變化?？谇唬毫飨?、出血、粘膜湯瘍、口臭等。鼻腔：鼻汁、出血、干燥（有些動物鼻鏡干燥）。眼：眼屎、流淚、白內(nèi)障、角膜損傷等。耳：外傷、耳殼曲折、貧血、中耳炎等。尾：彎曲、斷折等。四肢：彎曲、脫臼、外傷、關(guān)節(jié)炎等。肛門：下痢、血便、脫肛等。（2）營養(yǎng)狀況。被毛逆立、精神倦怠、瘦弱或過肥等屬于營養(yǎng)不良。（3）飼料、水攝入量。有無采食減少、食欲低下、過食等。（4）動物狀態(tài)。不活動、轉(zhuǎn)圈運動、臥地不起、跛行、痙攣等屬不正常。第58頁/共76頁動物的標記1．染色法染色法是用化學試劑在動物身體明顯部位如被毛、四肢等處進行涂染，或用不同顏色等來區(qū)別各組動物，是實驗室最常用、最容易掌握的方法。常用的標記液有：①3％～5％苦味酸溶液（黃色）。②0．5％中性紅或品紅浴液（紅色）。③2％硝酸銀溶液（咖啡色，涂后需光照10分鐘）。④煤焦油酒精溶液（黑色）。標記時用標記筆蘸取上述溶液，在動物體表不同部位涂上斑點，以示不同號碼。編號的原則是：先左后右，從前到后。第59頁/共76頁2．烙印法3．掛牌法4耳孔法一般來說，小型動物適宜用耳孔法和染色法，中型動物適用掛牌法和烙印法。第60頁/共76頁動物體重（g）日飼料量（g）日飲水量（ml）小鼠18~253~55~7大鼠120~25015~2020~25豚鼠400~60020~3030~120兔1500~250080~100150~200第61頁/共76頁第四節(jié)動物實驗中的基本操作一、實驗動物的抓取和固定1、小鼠2、大鼠3、豚鼠4、兔5、犬第62頁/共76頁二、實驗動物的麻醉三、實驗動物的給藥方法第63頁/共76頁四、體液的采集（一）、血液采集1）、小鼠、大鼠的尾靜脈采血2）、小鼠、大鼠眼眶靜脈叢采血3）、豚鼠的心臟采血4）、兔耳緣靜脈采血5）、兔耳中央動脈采血第64頁/共76頁（二）、消化液采集1）胃液