微生物技術要素宣貫昆明

微生物技術要素宣貫昆明第1頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四微生物專業(yè)認可特色

(與其他檢驗專業(yè)的區(qū)別)定性試驗多，統(tǒng)一標準難晚于其他專業(yè)認可，評審專家角色重要、甚至出現(xiàn)爭議（CNAS率先）對策：專家團隊專業(yè)知識全面、制定統(tǒng)一標準

出現(xiàn)的問題種類繁多從項目申報的問題到指導臨床，遍及全過程對策：系統(tǒng)學習認可知識，參加培訓宣貫專業(yè)知識獨特，進展多，變化快新老知識交叉出現(xiàn)對策：對于評審專家來講—-學習對于被評審單位—-我今講最新CLSI進展第2頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四主要講課內容新版

“應用說明”技術要素內容及理解：（醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則臨床微生物學檢驗領域的應用說明）CLSIM100-S22，即2012版生物安全內容在ISO15189中的體現(xiàn)第3頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則臨床微生物學檢驗領域的應用說明CNAS-GLxx：2012醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領域的指南CNAS-GL23：2008

第4頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四認可申請中常見問題—申報項目培養(yǎng)和鑒定（普通細菌6B010）：上呼吸道標本：與A組鏈球菌(分析物編碼即領域代碼前四位:6B070)、流感嗜血桿菌組合認可。下呼吸道標本:與肺炎鏈球菌(6B075)、流感嗜血桿菌組合認可。糞便：與沙門菌鑒定(6B085)+血清學分類(6B820)、志賀菌鑒定+血清學分類、霍亂弧菌鑒定+血清學分類組合認可腦脊液：與肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌組合認可藥物敏感性試驗（普通細菌6C010）：自動化儀器檢測法應與紙片擴散法和/或藥敏試驗（最低抑菌濃度）組合認可紙片擴散法應與藥敏試驗（最低抑菌濃度）組合認可第5頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四解讀“應用說明”

4管理要求4.1組織和管理4.1.1實驗室為獨立法人單位的，應有醫(yī)療機構執(zhí)業(yè)許可；

實驗室為非獨立法人單位的，其所屬醫(yī)療機構執(zhí)業(yè)證書的診療科目中應有醫(yī)學實驗室，自獲準執(zhí)業(yè)之日起，開展醫(yī)學檢驗工作至少2年。new!第6頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四

解讀“應用說明”

5技術要求5.1人員5.1.2微生物實驗室（以下簡稱“實驗室”）工作人員上崗前應接受辨色力檢查。5.1人員5.1.2微生物實驗室的工作人員在上崗前需接受辨色力檢查。需具備相關教育背景，并至少每年接受微生物專業(yè)技術及知識培訓，熟悉微生物學實驗室操作規(guī)程、消毒滅菌及生物安全知識。人員數(shù)量需滿足所提供的服務的要求。

(已刪除）第7頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.1.4實驗室負責人至少應具有以下資格：中級技術職稱，醫(yī)學、醫(yī)學檢驗專業(yè)背景，或相關專業(yè)背景經(jīng)過醫(yī)學檢驗培訓，3年臨床微生物工作經(jīng)驗。5.1.3實驗室負責人至少具有以下資格：a)醫(yī)學實驗室工作經(jīng)歷或培訓2年以上；或b)醫(yī)學實驗室相關專業(yè)高級技術職稱；或c)檢驗、生物化學、化學、生物科學等主修專業(yè)博士，醫(yī)學實驗室工作經(jīng)歷或培訓2年以上；或d)檢驗、生物化學、化學、生物科學等主修專業(yè)碩士，醫(yī)學實驗室工作經(jīng)歷或培訓4年以上；或檢驗、生物化學、化學、生物科學等主修專業(yè)學士，醫(yī)學實驗室工作經(jīng)歷或培訓8年以上。new!第8頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四認可的授權簽字人應至少具有中級以上專業(yè)技術職稱，從事申請認可授權簽字領域專業(yè)技術工作至少3年。當微生物實驗室作為醫(yī)學實驗室的一部分申請認可時，其負責人需有大學本科以上學歷或中級以上技術職稱，五年以上本專業(yè)工作經(jīng)歷。new!第9頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.1.6應每年對各級工作人員制定培訓計劃并進行微生物專業(yè)技術及知識培訓、質量保證/質量管理培訓、客戶服務培訓、安全培訓、繼續(xù)教育培訓。5.1.6實驗室需每年對各級工作人員制定培訓計劃并進行質量保證/質量管理訓、客戶服務培訓、安全培訓、繼續(xù)教育培訓。至少每6個月對人員進行勝任該崗位的考核，沒有通過崗位職責考核人員需再培訓和再考核，并記錄。

（已刪除）第10頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.2設施和環(huán)境條件5.2.1實驗室應有足夠的辦公、文字處理、培養(yǎng)基制備、實驗工作空間。宜有適當?shù)乃?、排水管道、電源插座、通風設施、通訊設備。5.2.1.1微生物實驗室建筑、設施需與實驗室從事的相應生物安全等級相符合。第11頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四(此頁為新增內容）5.2.2應定期根據(jù)工作流程及性質實施安全風險評估，根據(jù)生物安全理論和技術的新進展制定、修訂相應的生物安全操作和防護規(guī)程并進行培訓，以減小職業(yè)暴露的危險。當工作流程及性質發(fā)生變動時，應及時實施再評估。new!第12頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四評估考慮內容：微生物危險度≠風險評估

風險評估：

微生物危險度×合理的預防措施恒定不變×

0≈0

第13頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)5.2.2至少應規(guī)定如下安全要求：(a)不同控制區(qū)域的防護措施及合適的警告；(b)已知或有潛在經(jīng)空氣、氣溶膠傳播危險的標本或病原體在生物安全柜內操作；(c)標本安全運送及處理，如工作人員接種疫苗，戴手套和進行呼吸道防護（適用時），確保容器密封性，嗅平板時的潛在危害及其防護等；(d)滲漏標本的處理措施；(e)工作環(huán)境及設備的消毒措施new!第14頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.2.4實驗室內照明宜充足，避免陽光直射及反射，如果可能，可在實驗室內不同區(qū)域設置照明控制，以滿足不同實驗的需要。應有可靠的電力供應和應急照明。5.2.4實驗室內照明宜充足，避免陽光直射及反射，如果可能，可在實驗室內不同區(qū)域設置照明控制，以滿足不同實驗的需要。宜有可靠的（不一定需要不間斷電源或雙路供電）電力供應和應急照明。必要時，重要設備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等宜設專用電源。宜有適當?shù)臍怏w供應，以滿足工作類型及工作量的需要。第15頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.2.10應制定生物安全事故和危險品、危險設施等意外事故的預防措施和應急預案，并對全體人員進行培訓。（新增內容）(生物安全認可ISO15489，實驗室安全認可15490)new!第16頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.3實驗室設備5.3.1設備配置應與實驗室服務相適應，生物安全柜的類型和安裝應滿足工作要求；孵育箱的數(shù)量和種類應滿足診斷需要（如特殊溫度范圍和氣體要求）；應貯存與診斷相配套的質控物，以便在染色、試劑、試驗、鑒定系統(tǒng)和敏感性試驗中使用；無菌體液的顯微鏡檢查應配備細胞離心機。5.3.1設備配置需與實驗室服務相適應，如：有一定數(shù)量和類型的孵育箱，以滿足診斷需要（如特殊溫度范圍）；貯存與診斷相配套的質控物，以便在染色、試劑、試驗、鑒定系統(tǒng)和敏感性試驗中使用；腦脊液檢查配備細胞離心機。new!第17頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四DiagramCleanbenchClassIBSCClassIIBSCClassIIIBSC生物安全柜與潔凈臺：風向+與外界相連

BSL-3百萬級Lab分子生物學Lab

3.生物安全柜與潔凈臺的區(qū)別第18頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四實驗室結構（負壓）與生物安全柜？第19頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.3.2設備校準、維護及性能等應符合如下要求：（a）自動化鑒定儀、血培養(yǎng)儀的校準應滿足制造商建議；（b)每半年進行檢定或校準的設備至少應包括濁度儀；(c)每年進行檢定或校準的設備至少應包括：生物安全柜（高效過濾器、氣流、負壓等參數(shù)）、CO2濃度檢測儀、細胞離心機、壓力滅菌器、游標卡尺、培養(yǎng)箱、溫度計、移液器、微量滴定管或自動分配器。(d)應保存儀器功能監(jiān)測記錄的設備至少應包括：溫度依賴設施（冰箱、孵育箱、水浴箱、加熱塊等每日記錄溫度）、CO2培養(yǎng)箱（每日記錄CO2濃度）、超凈工作臺（定期做無菌試驗）、壓力滅菌器（至少每個滅菌包外貼化學指示膠帶、內置化學指示卡，定期進行生物監(jiān)測）；(e)應制定預防性維護計劃并記錄的設備至少應包括：生物安全柜；CO2培養(yǎng)箱、自動化鑒定儀、血培養(yǎng)儀、壓力滅菌器、超凈工作臺、顯微鏡和離心機。new!第20頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四(此頁為新增內容)5.3.4所有試劑應標注或能追溯的信息包括：名稱、濃度或滴度，存放條件，失效期。若試劑啟封，改變了有效期和儲存條件，宜記錄新的有效期。試劑的儲存條件應遵循生產(chǎn)商的建議，并在標明的有效期內使用。培養(yǎng)基標簽應包含生產(chǎn)日期（批號）、保質期（或失效期），適用時包括配方、質量控制、貯存條件等信息。藥敏用標準菌株種類和數(shù)量應滿足實驗室工作要求，并保存其來源、傳代等記錄，并有證據(jù)表明標準菌株性能滿足要求。5.3.7如果設備故障影響了方法學性能，在設備修復、校準后，實驗室應對設備性能進行驗證，例如檢測質控菌株或已知結果的標本。new!第21頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.4檢驗前程序5.4.1檢驗申請單應包括標本來源和臨床診斷，必要時說明感染類型和/或目標微生物，宜提供抗菌藥物使用信息。5.4.1檢驗申請單需包括標本來源，必要時說明感染類型和/或目標微生物。new!第22頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.4.3除通用要求外，微生物標本的采集及運送指南，還應包括以下內容：不同部位標本的采集方法。如：明確說明并執(zhí)行血培養(yǎng)標本采集的消毒技術、合適的標本量。診斷成人不明原因發(fā)熱、血流細菌感染時宜在不同部位抽血2套，每套2瓶（需氧、厭氧各一瓶）。合格的標本類型、送檢次數(shù)、標本量。如：痰標本直接顯微鏡檢查找結核桿菌或結核桿菌培養(yǎng)，應送檢三份痰標本。最好至少連續(xù)3日，采集每日清晨第一口痰。明確規(guī)定需要盡快運送的標本；5.4.3除一般要求外，微生物標本的采集及運送指南，需特別注意以下內容：a)不同部位標本的采集方法。如：明確說明并執(zhí)行血培養(yǎng)標本采集的消毒技術、合適的標本量；b)合格的標本類型、送檢次數(shù)、標本量。如：糞便常規(guī)培養(yǎng)在未向專業(yè)人員咨詢前，每位患者采集標本不多于2份；c)需明確規(guī)定需要盡快運送的標本，以最大程度地減少延誤并盡快處理；new!第23頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.5檢驗程序

5.5.1細菌培養(yǎng)和鑒定程序應滿足如下要求：所選擇的涂片、染色技術、培養(yǎng)基應能從標本中分離、識別相應的病原菌；鑒定方法應符合要求（如：通過血清學、革蘭染色、菌落形態(tài)、生長條件、代謝反應、生化和酶活性、抗菌藥物耐藥性譜等特性鑒定）；應有處理組織標本的能力。應明確傷口標本培養(yǎng)程序，深部傷口感染應至少包括標本采集、需氧菌及厭氧菌的培養(yǎng)及鑒定。如果不具備厭氧培養(yǎng)條件，則應有程序表明，標本置合格的運送系統(tǒng)迅速送有條件的實驗室。應有適當?shù)姆椒z測苛養(yǎng)菌（如放線菌，快速生長的分枝桿菌等）。(少了一句：最好進行直接涂片革蘭染色檢查并報告結果。）厭氧菌培養(yǎng)時間與標本類型、診斷有關，在第一次培養(yǎng)評估之前應有足夠的培養(yǎng)時間（至少48小時）。應有合適的液體培養(yǎng)基，有合適的鑒定方法（適用時）。第24頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四細菌抗菌藥物敏感性試驗程序應滿足如下要求：(a)應制定常規(guī)藥敏試驗方法（紙片擴散法、瓊脂稀釋法、微量肉湯稀釋法、E試驗或其他）的操作程序（含各類病原體和/或標本的檢測藥物、質控標準、結果解釋等）；(b)抗菌藥物敏感性試驗方法包括紙片擴散法、稀釋法（瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法）、濃度梯度擴散法（E試驗）或自動化儀器檢測；實驗室應提供與服務相適應的抗菌藥物敏感性試驗；(c)抗菌藥物敏感性試驗方法及結果判斷至少應遵循上一年的標準?？咕幬锩舾行栽囼灧椒ò埰瑪U散法、稀釋法（瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法）、濃度梯度擴散法（E試驗）或自動化儀器檢測。實驗室需遵循一定的準則，提供與服務相適應的抗菌藥物敏感性試驗，并能檢測苯唑西林耐藥葡萄球菌、萬古霉素耐藥腸球菌、碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌等。new!第25頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四2012年新增指標新增指標名稱要求8急診患者抗菌藥物處方比例＜40%9住院患者特殊使用抗菌藥物使用率10限制使用抗菌藥物治療住院患者微生物樣本送檢率＞50%11特殊使用抗菌藥物治療住院患者微生物樣本送檢率＞80%12特殊使用抗菌藥物使用強度第26頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四2012年衛(wèi)生部明確要求7種I類切口手術：①腹股溝疝修補術（包括補片修補術）②

甲狀腺疾病手術③

乳腺疾病手術④

關節(jié)鏡檢查手術

⑤

頸動脈內膜剝脫術

⑥

顱骨腫物切除術⑦

經(jīng)血管途徑介入診斷手術

原則不使用抗菌藥物！第27頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四2011年上級要求：7項指標指標名稱要求1住院患者抗菌藥物使用率＜60%2門診患者抗菌藥物處方比例＜20%3I類切口手術患者預防使用抗菌藥物比例＜30%4預防用抗菌藥物術前0.5-2h內給藥百分率100%5I類切口預防用抗菌藥物時間≤24h的比例100%6抗菌藥物患者微生物檢驗樣本送檢率＞30%7抗菌藥物使用強度（DDD）＜40第28頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四重癥醫(yī)學科41株金葡藥敏情況（92.7％MRSA）第29頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四急診病房+急診ICU40株金葡藥敏情況(100%MRSA)第30頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四兒科病房50株金葡藥敏情況（8%MRSA）第31頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四醫(yī)院前10位：口服劑型（按頻度）2012.42012.32012.2莫西沙星（拜復樂）莫西沙星（拜復樂）莫西沙星（拜復樂）頭孢唑肟頭孢唑肟頭孢唑肟依替米星（創(chuàng)成）依替米星（創(chuàng)成）左氧氟沙星（利復星）左氧氟沙星（利復星）左氧氟沙星（利復星）依替米星（創(chuàng)成）阿莫西林/克拉維酸頭孢他啶（復達欣）頭孢哌酮/舒巴坦頭孢哌酮/舒巴坦阿莫西林/克拉維酸阿莫西林/克拉維酸乳糖酸阿奇霉素乳糖酸阿奇霉素磷霉素左氧氟沙星（可樂必妥）左氧氟沙星（可樂必妥）左氧氟沙星（可樂必妥）氨曲南頭孢哌酮/舒巴坦乳糖酸阿奇霉素頭孢呋辛鈉750mg磷霉素氨曲南第32頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四33

CLSI2012年藥敏試驗標準的更新點

第33頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四34

CLSI藥敏標準–

2012年1月M100-S22表格(2012)*M02-A11紙片擴散法(2012)^M07-A9MIC法(2012)^*M100每年更新一次#M02,M07每三年更新一次第34頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四

M1002012改變腸桿菌科菌銅綠假單胞菌葡萄球菌屬35第35頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四腸桿菌科菌-20121.澄清了何時進行ESBL檢測-簡短地2.澄清了何時進行MHT試驗3.重新修訂了厄他培南折點--針對2011年公布折點進行修訂4.增加了環(huán)丙沙星對于傷寒沙門菌和腸道外沙門菌的折點36第36頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四MHT:碳青霉烯酶分類類碳青霉烯酶發(fā)現(xiàn)于注釋AKPC腸桿菌科菌水解所有beta內酰胺類。被克拉維酸抑制。SME粘質沙雷菌B金屬酶(IMP,VIM,GIM,SPM,NDM)銅綠假單胞菌腸桿菌科菌

不動桿菌嗜麥芽窄食單胞菌水解除氨曲南的所有beta內酰胺類。被克拉維酸輕度抑制。發(fā)揮酶活性需要鋅離子;被EDTA抑制.37Reference:Queenan&Bush.2007.ClinMicrobiolRev.20:4402.澄清了何時進行MHT第37頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四38

如果實驗室沒有使用最新的碳青霉烯折點，仍然需要進行MHT試驗….

如果實驗室已經(jīng)使用最新的折點，那MHT只需要根據(jù)流行病學或感控目的進行。并不是所有碳青霉烯酶腸桿菌科菌均為MHT陽性，并且非碳青霉烯酶導致的碳青霉烯耐藥菌株也可能MHT陽性。澄清了何時進行MHT：“修訂的碳青霉烯酶評論”Reference:M100-S22;Table2A,pages45,53&57第38頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四為什么CLSI再次更改厄他培南對腸桿菌科菌的折點？2011折點主要基于:當時已知的對腸桿菌科菌的MIC分布PK/PD數(shù)據(jù)綜述(保守地定為S≤0.25μg/ml)非常有限的臨床數(shù)據(jù)(沒有病人的厄他培南MIC=0.5μg/ml)2012折點主要基于:進一步的數(shù)據(jù)表明厄他培南MIC為0.5μg/ml的菌株不產(chǎn)碳青霉烯酶進一步的PK/PD數(shù)據(jù)綜述進一步的臨床數(shù)據(jù)ESBL+大腸埃希菌厄他培南敏感(MIC=0.5)的臨床反應39第39頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四40CLSI

文件MIC(μg/ml)紙片擴散(mm)敏感中介耐藥敏感中介耐藥M100-S20(Jan.2010)≤24≥8≥1916-18≤15M100-S20U(June2010)≤0.250.5≥1≥2320-22≤19M100-S22(Jan2012)**≤0.51.0≥2≥2219-21≤183.重新修訂厄他培南折點

(在2011年折點上進行修訂)第40頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四4.增加環(huán)丙沙星對傷寒沙門菌和腸道外沙門菌的折點故事….對于傷寒沙門菌和腸道外沙門菌感染，當菌株為“環(huán)丙沙星敏感性降低的菌株”時，環(huán)丙沙星的臨床療效較差。MICs為0.12–1.0μg/ml以往的版本提示這可以通過萘啶酸紙片擴散法試驗檢測。然而，目前有菌株通過攜帶新的耐藥機制導致環(huán)丙沙星敏感性下降=無法用萘啶酸紙片擴散法試驗簡便地檢測出。2012新的環(huán)丙沙星折點對于“中介”菌株的新注釋修訂對萘啶酸紙片擴散法試驗的推薦

41References:Crumpetal.2008.AntimicrobAgentsChemother.52:1278 Parryetal.2010.AntimicrobAgentsChemother.54:5201第41頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四假如氟喹諾酮類敏感，那么進行萘啶酸藥敏試驗以檢測氟喹諾酮類降低的敏感性如果萘啶酸耐藥…….通知臨床醫(yī)生…“該菌株可能無法通過氟喹諾酮類藥物清除；建議咨詢感染病專家.”42腸道外沙門菌:萘啶酸-舊的推薦Reference:M100-S21.Table2A.Page46.第42頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四沙門菌屬.

氟喹諾酮耐藥基因型表型萘啶酸環(huán)丙沙星MIC(μg/ml)沒有耐藥基因常敏感≤0.06gyrA(單突變)1染色體常耐藥0.12-1.0gyrA,gyrB(多突變)染色體耐藥≥4qnr+/-;aac(6’)-lb-cr2

質粒

(新機制)常敏感0.12-1.0431低水平耐藥(敏感性降低);用“標準”的腸桿菌科環(huán)丙沙星折點檢測不出2qnr基因編碼DNA解旋酶保護蛋白；aac(6’)1b-cr修飾喹諾酮使之不太有效。有報道傷寒沙門菌和腸外沙門菌可通過此類機制導致治療反應性延遲。第43頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四腸桿菌科菌:

2012環(huán)丙沙星折點

菌株DD(mm)MIC(μg/ml)敏感中介耐藥敏感中介耐藥腸桿菌科菌（除外傷寒沙門菌和腸外沙門菌）(與其他腸道菌一致)≥2116-20≤15≤12≥4傷寒沙門菌和腸外沙門菌≥3121-30≤20≤0.060.12-0.5≥144Reference:M100-S22.Table2A.Page482012新不必再用萘啶酸試驗進行篩查第44頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四傷寒沙門菌和腸外沙門菌:

環(huán)丙沙星檢測最好測定環(huán)丙沙星MIC在2012年新折點要求的低MIC范圍可能無法在某些自動化系統(tǒng)中實現(xiàn)考慮Etest?如果進行紙片擴散法試驗，需同時進行萘啶酸和環(huán)丙沙星試驗：萘啶酸適用于解旋酶突變菌株(gyrA)環(huán)丙沙星適用于質粒介導的基因突變對其他氟喹諾酮類藥物（如左氧氟沙星）的折點正在評估中45第45頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四銅綠假單胞菌1.Beta內酰胺類抗生素:以下藥物折點降低:哌拉西林哌拉西林-他唑巴坦替卡西林替卡西林-克拉維酸2.碳青霉烯:以下藥物折點降低:亞胺培南1美羅培南2增加多利培南3折點46第46頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四47銅綠假單胞菌:

折點修改Agent舊M100-S21新M100-S22敏感中介耐藥敏感中介耐藥哌拉西林≤64-≥128≤1632-64≥128哌拉西林-他唑巴坦≤64/4-≥128/4≤16/432/4-64/4≥128/4替卡西林≤64-≥128≤1632-64≥128替卡西林-克拉維酸≤64/2-≥128/2≤16/232/2-64/2≥128/2Reference:M100-S22.Table2B-1.Page63對應的紙片擴散法折點也已修改.第47頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四1.Beta內酰胺類藥物折點降低:

銅綠假單胞菌MIC折點目前已與腸桿菌科菌一致(在紙片擴散法折點上有細微差別).當使用新的降低折點，菌株若敏感，則不需再聯(lián)合治療。.刪除:表2B-1注釋-“Rx:

對與bata內酰胺類敏感的菌株，需要用高劑量治療銅綠假單胞菌引起的嚴重感染。對于此類感染，單藥治療可能導致臨床失敗。.”48第48頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四49銅綠假單胞菌:

折點更新藥物舊(M100-S21)新M100-S22敏感中介耐藥敏感中介耐藥多利培南None≤24≥8亞胺培南≤48≥16≤24≥8美羅培南≤48≥16≤24≥8Reference:M100-S22.Table2B-1.Page63相應的DD折點也已更改.第49頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四葡萄球菌屬青霉素試驗50第50頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四葡萄球菌屬.–青霉素故事…..>90%的葡萄球菌對青霉素“耐藥”青霉素極少考慮用于葡萄球菌感染的治療…然而—，當青霉素“敏感”時，青霉素可考慮用于需長期治療的感染類型（比如心內膜炎和骨髓炎）某些葡萄球菌通過MIC或紙片擴散法檢測為敏感，但可能攜帶beta內酰胺酶并導致青霉素治療失敗。51第51頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四葡萄球菌.–青霉素CLSI以往推薦:當下列情況時，報告青霉素“敏感”前需進行誘導beta內酰胺酶試驗:

抑菌圈直徑≥29mmMIC≤0.12μg/ml也可考慮進行blaZbeta內酰胺酶基因的PCR青霉素折點MIC(μg/ml)抑菌圈(mm)SIRSIR≤0.12-≥0.25≥29-≤2852Reference:M100-S21.Table2C.Page70第52頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四誘導beta內酰胺酶試驗53血平板傳種菌株誘導:貼紙片以誘導beta內酰胺酶產(chǎn)生(e.g苯唑西林或頭孢西丁)過夜孵育檢測抑菌圈邊緣的菌落假如BL陽性，報告青霉素耐藥PosNeg第53頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四金黃色葡萄球菌

β-內酰胺酶(BL)誘導頭孢硝噻吩beta內酰胺酶試驗常常可以，但不總能檢測出葡萄球菌的beta內酰胺酶。其他beta內酰胺酶試驗更加敏感:Cloverleaf試驗青霉素抑菌圈邊緣試驗blaZ基因檢測并非最佳blaZ編碼beta內酰胺酶有多種blaZ基因型

54第54頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四金黃色葡萄球菌

β-內酰胺酶(BL)研究348MSSA(低的青霉素MICs)由blaZ-PCR檢測:303PCR陰性45PCR陽性方法:青霉素MICsBeta內酰胺酶表型試驗頭孢硝噻吩-Cefinase頭孢硝噻吩-DryslideCloverleaf試驗青霉素抑菌圈邊緣試驗55*StatensSerumInstitut(Denmark),CDC(Atlanta),MGH(Boston)第55頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四金黃色葡萄球菌

β-內酰胺酶(BL)研究青霉素MIC(μg/ml)blaZ功能陰性陽性0.00820.016150.03218010.069050.1215170.251140.5

41.0

2.024.01303451blaZ陰性

而青霉素“耐藥”23blaZ陽性而青霉素“敏感”Reference:CLSIAgendaBookJanuary2011.SR第56頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四57Cloverleaf試驗檢測beta內酰胺酶陽性金葡菌5%羊血平板S.aureusATCC25923作為指示菌株1單位青霉素紙片陰性(青霉素敏感)菌株某些結果難以判讀Reference:CLSIAgendaBookJanuary2011.

菌株A-D均為BL陽性ABCDBL陰性第57頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四58金黃色葡萄球菌

紙片抑菌圈邊緣試驗(10U

青霉素紙片和標準紙片擴散法試驗)模糊/“沙灘樣”=Β內酰胺酶陰性,青霉素敏感銳利/“懸崖樣”=Β內酰胺酶陽性,青霉素耐藥S.aureusQC:

陰性-ATCC25923陽性-ATCC29213(補充QC)Reference:M100-S22.Table2CSupplementalTable1.Page83第58頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四金黃色葡萄球菌

3實驗室beta內酰胺酶研究結果(N=348)試驗敏感性特異性Cefinase77%100%Dryslide88%100%Cloverleaf100%100%Penicillin抑菌圈邊緣試驗96%100%59Reference:CLSIAgendaBookJanuary,2011第59頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四60青霉素MIC≤0.12μg/ml頭孢硝噻吩beta內酰胺酶陽性報告青霉素“耐藥”頭孢硝噻吩beta內酰胺酶陰性進行青霉素抑菌圈邊緣試驗模糊邊緣報告青霉素“敏感”銳利邊緣報告青霉素“耐藥”金黃色葡萄球菌

青霉素(MIC≤0.12μg/ml)報告注釋:若常規(guī)進行紙片擴散法試驗，則僅檢測抑菌圈edge!M100-S22.Table2CSupplementalTable1.Page80第60頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四葡萄球菌.–青霉素

選擇策略假如青霉素“耐藥”，報告結果假如青霉素“敏感”，隱藏結果并添加注釋：“若需青霉素結果請聯(lián)系實驗室”若青霉素“敏感”且臨床要求報告，則:金葡菌頭孢硝噻吩試驗，若陰性

青霉素抑菌圈邊緣試驗凝固酶陰性葡萄球菌(包括路登葡萄球菌)誘導性頭孢硝噻吩試驗61第61頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四(此頁已刪除）痰培養(yǎng)需包括肺炎鏈球菌、、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌科細菌的分離，若標本被唾液嚴重污染，可以不鑒定全部細菌或不做藥敏試驗；呼吸道和耳鼻喉標本需能分離β溶血鏈球菌和嗜血桿菌屬；支氣管肺泡灌洗液和支氣管鏡檢查標本需能定量培養(yǎng)。尿液常規(guī)進行定量培養(yǎng)（菌落計數(shù)），需能分離、鑒定革蘭陽性和/或革蘭陰性細菌。泌尿生殖道標本需有合適條件培養(yǎng)淋病奈瑟菌；陰道炎患者標本需進行革蘭染色；如開展孕婦（懷孕35-37周）B群鏈球菌的篩查，藥敏試驗需包括林可霉素和紅霉素。糞便標本需能分離、鑒定腹瀉相關病原菌（如沙門菌屬、志賀菌屬、耶爾森桿菌屬、彎曲菌屬、腸出血性大腸桿菌、嗜水氣單胞菌），結果報告需標明具體的細菌名稱，如未檢出沙門菌屬、志賀菌屬等；無癥狀攜帶者，常規(guī)使用增菌培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基；需能檢測霍亂弧菌、艱難梭菌；粘性較低的培養(yǎng)標本，宜進行直接顯微鏡檢查。年齡大于6個月，有抗菌藥物治療史的嚴重腹瀉患者，糞便常規(guī)培養(yǎng)無異常發(fā)現(xiàn)時，可檢測艱難梭菌毒素。腦脊液培養(yǎng)標本需立即處理，常規(guī)進行革蘭染色，培養(yǎng)基和孵育條件確保能培養(yǎng)常見苛養(yǎng)菌（腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、產(chǎn)單核細胞李斯特菌、諾卡菌等）；需根據(jù)實驗室制定的危急值處理規(guī)程報告陽性結果（包括顯微鏡檢查結果）；抗原試驗，無論結果為陽性還是陰性，需再進行細菌培養(yǎng)；最好有其他方法檢測不能培養(yǎng)或難培養(yǎng)的細菌。第62頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四分枝桿菌：標本應置密閉的防滲漏容器內；某些標本（如：尿液、腦脊液）抗酸染色應濃縮，所有標本培養(yǎng)前應濃縮。應以密閉試管置密封的離心架內離心。分枝桿菌：標本需置密閉的防滲漏容器內；某些標本（如：尿液、痰液）抗酸染色及培養(yǎng)前應濃縮。需以密閉的螺旋蓋試管置密封的離心架內離心，以最大程度減少氣溶膠危害。需進行原始標本涂片分枝桿菌熒光染色；常規(guī)培養(yǎng)在35-37℃，當臨床有特殊說明（某些特殊菌屬）時，可置30-32℃或42℃。標本量大時，至少接種2類培養(yǎng)基。需在收到標本24小時內報告抗酸染色結果。

第63頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四真菌培養(yǎng)宜使用含和不含抗菌藥物的兩類培養(yǎng)基。如果在室溫下培養(yǎng)，應每天監(jiān)測并記錄室溫（22℃-26℃）。經(jīng)空氣傳播有高度感染性的真菌標本、含菌絲體的真菌應在生物安全柜內處理。若采用平皿培養(yǎng)，應封蓋。真菌：需選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基和環(huán)境，以保證分離重要的致病菌，并盡量減少污染；分離和鑒定程序需包括直接鏡檢或染色鏡檢（如10％KOH，墨汁染色或吉姆薩染色）、合適的選擇性培養(yǎng)基、孵育溫度以及藥敏試驗。需準備兩種培養(yǎng)基（含或不含抗菌藥物）。如果在室溫下培養(yǎng)，需每天監(jiān)測并記錄室溫（22-26℃）以確定室溫持續(xù)滿足真菌的生長。

提供鑒定服務的實驗室，需建立完善的真菌鑒定程序，包括玻片培養(yǎng)（必要時），生化反應，營養(yǎng)試驗（必要時）。否則需送有條件的實驗室鑒定。經(jīng)空氣傳播有高度傳染性的微生物標本、含菌絲體的真菌需在生物安全柜或安全罩內處理。若采用平板培養(yǎng)，需有適當?shù)陌踩胧ㄈ绶馍w），以防止平板意外打開。只有具備嚴格的、適當?shù)陌踩胧┎拍苓M行玻片培養(yǎng)。第64頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四病毒：培養(yǎng)時，應詳細記錄細胞類型、傳代數(shù)、細胞來源、培養(yǎng)基及生長狀況；應檢測并記錄培養(yǎng)基和稀釋劑的無菌試驗和pH；應監(jiān)測細胞病變效應，以優(yōu)化培養(yǎng)的最佳時間。應比較未經(jīng)接種或接種無菌物質的單層細胞與接種臨床標本的培養(yǎng)物。病毒：單層細胞應孵育一定時間，以滿足相應病毒的生長要求；需詳細記錄細胞類型、傳代數(shù)、細胞來源、培養(yǎng)基及生長狀況；需檢測并記錄培養(yǎng)基和稀釋劑的無菌試驗和pH；需監(jiān)測細胞病變效應，以優(yōu)化培養(yǎng)的最佳時間。宜比較未經(jīng)接種或接種無菌物質的單層細胞與接種臨床標本的培養(yǎng)物。需建立程序，對定量血清試驗的紅細胞懸液進行檢測并標準化。工作表和/或記錄需顯示試劑或參比血清的滴度（如果可能），以及檢測結果的實際滴度。所有血清學試驗檢測抗原或抗體，需設立陽性和陰性對照。第65頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四（此頁已刪除）寄生蟲：實驗室需與臨床醫(yī)師協(xié)商制定寄生蟲常規(guī)檢驗操作規(guī)程并遵循，其中包括常規(guī)寄生蟲學試驗糞便標本的采集時間、次數(shù)、標本量。糞便顯微鏡檢查蟲卵和寄生蟲，需包括濃縮過程和固定染色試驗；新鮮稀便顯微鏡檢查需包括直接濕片檢查，以觀察寄生蟲的動力。血液寄生蟲（瘧原蟲或其他血源性寄生蟲）顯微鏡檢查應制備厚血涂片和薄血涂片，陽性結果按《傳染病法》中疫情報告程序上報。血涂片檢驗瘧原蟲陽性時，需同時報告鑒定結果。分子微生物學：每次患者標本核酸提取、準備過程（手工或自動化），需平行設立陰陽性質控。需規(guī)定并記錄所有孵育（反應）溫度。如果孵育溫度超出規(guī)定范圍，需在發(fā)報告前采取糾正措施。試驗操作和結果報告需遵循制造商的建議，而不用其他試劑、探針取代。第66頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四對我國法定傳染病病原微生物的檢驗程序應滿足如下要求：（a）檢驗程序應至少符合中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準；（b）當培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)人間傳染的高致病性病原微生物（依據(jù)?人間傳染的病原微生物名錄?）時，應按相關法規(guī)要求進行處理，或送至相應級別的生物安全實驗室進行檢驗。（此頁為新增）new!第67頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.5.2應按優(yōu)先順序依次選擇標準菌株、質控菌株或其它已知菌株對商業(yè)鑒定系統(tǒng)（包括自動、半自動、手工）每種板（條/卡/管）的鑒定/藥敏結果符合性進行驗證。（新增內容）5.5.3除通用內容外，檢驗程序還應包括適宜的培養(yǎng)環(huán)境和足夠的培養(yǎng)時間；初次分離用非選擇性培養(yǎng)基的平板直徑應不小于9cm，應只接種一份標本。5.5.2需制定程序驗證所有環(huán)節(jié)，包括染色、試劑、培養(yǎng)基、抗血清和分析軟件等符合預期性能。需規(guī)定特殊病原體的識別、隔離、報告，以及特殊處理程序。5.5.3除一般內容外，程序還需包括適宜的培養(yǎng)環(huán)境和足夠的培養(yǎng)時間；非選擇性培養(yǎng)基（平板直徑大于9cm）宜只接種一份標本。需能夠盡快完成白喉桿菌、氣性壞疽菌群、炭疽桿菌、肉毒梭菌和破傷風桿菌檢測；痰標本需進行常規(guī)涂片、革蘭染色，以確定標本的可接受性或培養(yǎng)范圍。new!第68頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.5檢驗程序（續(xù)前）5.5.3.3微生物SOP特殊書寫內容：氣性壞疽（例：外科特色醫(yī)院：產(chǎn)氣莢膜）

：操作時防止氣體膨脹

炭疽肉毒梭菌破傷風第69頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.6檢驗程序的質量保證5.6.1實驗室制定的內部質量控制程序應包括整個實驗操作過程，如實驗分析前、中、后（報告）。質量控制應滿足如下要求：（a）使用中的染色劑（革蘭染色、特殊染色和熒光染色），至少每周用已知陽性和陰性（適用時）的質控菌株檢測染色程序。（b）凝固酶、過氧化氫酶、氧化酶、β內酰胺酶，實驗當日應做陰性和陽性質控，商業(yè)頭孢菌素試劑的β內酰胺酶試驗可遵循制造商的建議。診斷性抗血清試劑，實驗當日至少應做多價血清陰性和陽性質控。定性試驗試劑每次檢測時應至少包括陽性和陰性質控菌株或樣本。不含內質控的直接抗原檢測試劑，實驗當日應檢測陽性和陰性質控。（c）實驗室常規(guī)采用的藥敏試驗方法應以標準菌株連續(xù)檢測20－30天，每一組藥物/微生物超出參考范圍（抑菌圈直徑或MIC）的頻率應小于1/20或2/30。此后，應每周使用標準菌株對藥敏試驗進行質控。應保存抗菌藥物敏感性試驗資料，并至少每年向臨床醫(yī)師報告。第70頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四5.6質控（續(xù)前）藥物敏感試驗室內質控每周一次（首次連做20-30天，不合格1/20或3/30）注意事項：注意質控用菌種性狀保持第71頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四厭氧菌應以有效的方法檢測厭氧培養(yǎng)環(huán)境（如以亞甲蘭試條、厭氧菌或適當?shù)某绦驒z測厭氧系統(tǒng)的厭氧條件）。分枝桿菌抗酸染色應在實驗當日用適當?shù)年幮院完栃再|控驗證；熒光染色應每次實驗以陰性和陽性質控驗證。厭氧菌：需以有效的方法檢測厭氧培養(yǎng)環(huán)境（如以亞甲蘭試條、厭氧菌或適當?shù)某绦驒z測厭氧系統(tǒng)的厭氧條件）。當厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)出現(xiàn)問題時，需及時處理，必要時通知送檢者。分枝桿菌：抗酸染色需在實驗的每天用適當?shù)年栃院完幮再|控驗證；熒光染色需每次以陰性和陽性對照驗證。第72頁，共80頁，2023年，2月20日，星期四真菌直接染色（如：抗酸染色，PA