實驗一細胞形態(tài)細胞器的顯微結(jié)構(gòu)的觀察

實驗一細胞形態(tài)細胞器的顯微結(jié)構(gòu)的觀察第1頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗?zāi)康?.了解普通光學顯微鏡的工作原理，掌握光學顯微鏡的使用方法。2.熟悉光學顯微鏡下細胞的基本形態(tài)與結(jié)構(gòu)。第2頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗原理細胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位。構(gòu)成生物機體的細胞是多種多樣的。要對細胞進行研究，首先要從其形態(tài)結(jié)構(gòu)人手。所以，要借助顯微鏡的成像及放大原理，在顯微鏡下，才能觀察到細胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。第3頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。第4頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力有關(guān)。制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計的最大放大倍數(shù)通常為1000X。第5頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四顯微鏡的分辨率:也稱為分辨力，它是指能把兩個物點辨清的最小距離，分辨距離越大，則分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距離來表示的。其計算公式為:D=0.61λ/N·AN·A·=n·sina/2

式中D為分辨率，A為光波波長，n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角），

N·A·為物鏡的數(shù)值孔徑(鏡口率)。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。

第6頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，公式為:M=K1xK2焦點深度:顯微鏡調(diào)焦到看清標本某一點時，不僅是這一物點，而且它的上下兩側(cè)也能看清楚兩側(cè)的厚度叫做焦點深度。看到標本的全厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋仔細地從上到下進行觀察。第7頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四厚標本和薄標本4-5um2um基礎(chǔ)知識第8頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四基礎(chǔ)知識三、顯微鏡概述

顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。1.光學顯微鏡普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(載物臺)、調(diào)節(jié)器和、物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)等。尼康E-600顯微鏡

第9頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四2.體視顯微鏡（可直接進行解剖及觀察并具有正像立體感）第10頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四3.熒光顯微鏡

尼康E800熒光DIC顯微鏡

熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）

第11頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上。2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。第12頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四4.激光共聚焦掃描顯微鏡（具有高分辨率可進行顯微斷層掃描）

LCSM照片藍色為細胞核，綠色為微管

（能觀察活細胞）第13頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四5.暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）的聚光鏡中央有當光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。6.相差顯微鏡

一種介殼蟲的染色體

第14頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四7.偏光顯微鏡（對于雙折射物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)研究）

偏光顯微鏡（polarizingmicroscope）用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。8.微分干涉差顯微鏡（圖像具有浮雕感）

DIC顯微鏡其優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。

DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）

第15頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四9.倒置顯微鏡（組織培養(yǎng)中長工作距離的）組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上（右圖），用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。第16頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四10.顯微操作技術(shù)

尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

第17頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四四、實驗用品各種組織切片第18頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四五、

實驗步驟

(一)顯微鏡的使用1.觀察前的準備工作

(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習慣，觀察時要雙眼同時睜開，一邊觀察一邊進行記錄或描繪。

(2)觀察時所用的材料、藥品和各種器具要預(yù)先準備好。

(3)顯微鏡在使用之前應(yīng)檢查一下它的各個部件是否完整和正常，并對載物臺、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進行必要的清潔工作。然后進行合軸調(diào)節(jié)。第19頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四瞳距調(diào)節(jié)2.顯微鏡的調(diào)節(jié)第20頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)第21頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)旋鈕第22頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場光欄③孔徑光欄②10X物鏡①標本④聚光鏡升降旋鈕第23頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四孔徑光欄調(diào)節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物第24頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四孔徑光欄開度與圖象100%70%30%第25頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四孔徑光欄的運用第26頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟如下:(1）可變光欄的中心對準聚光鏡的中心。如果可變光欄的水平是固定的，則裝配時已保證它與聚光鏡合軸，不必調(diào)整;如果可變光欄的水平位置可以移動，則應(yīng)把可變光欄關(guān)到最小，使它的中心孔對準聚光鏡下方的透鏡中心。

(2)載物臺上放置觀察標本，把聚光器上升到它上端透鏡平面稍低于載物臺平面的高度，并將它的可變光欄開到最大，用低倍物鏡，進行調(diào)焦到能看見標本，可調(diào)反射鏡使視野得到最亮和最均勻的照明，或把光欄關(guān)小，最亮的照明區(qū)正處在視野的中央。

(3)轉(zhuǎn)到高倍鏡，并調(diào)焦到看清標本，然后去掉標本，拔出目鏡，眼睛直接向鏡筒觀察，并把可變光欄關(guān)小，看其亮點是否在視野中心，如果不是，就要轉(zhuǎn)動聚光器的調(diào)節(jié)螺旋，把亮點調(diào)到視野中央，再慢慢開啟可變光欄，使視野看到光欄邊緣和聚光鏡的邊緣相接為止。第27頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四3.觀察操作：(1)低、高倍鏡的使用:先把低倍的物鏡用粗調(diào)焦螺旋下降至離蓋玻片0.5cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標本移到視野中心，用細調(diào)焦螺旋把物鏡調(diào)至最清晰處，若要用高倍鏡觀察時，把所要進一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時針轉(zhuǎn)換成高倍物鏡，然后用細調(diào)焦螺旋調(diào)焦，至看清物像。

第28頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四(2)兔肝細胞蘇木精-伊紅(H·E·)染色玻片標本的觀察先在干燥系物鏡下觀察