第八章微生物遺傳變異與菌種保藏

第八章微生物遺傳變異與菌種保藏本章內(nèi)容第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變及修復(fù)第三節(jié)基因重組第四節(jié)微生物育種第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯及保藏

第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)三個經(jīng)典實驗：轉(zhuǎn)化實驗噬菌體的感染實驗植物病毒的重建實驗實驗材料：實驗方法：動物實驗細菌培養(yǎng)實驗S型菌無細胞抽提液試驗（一）轉(zhuǎn)化實驗Griffith（1928）Avery（1944）實驗材料：肺炎雙球菌光滑型（S）粗糙型（R）有莢膜菌落光滑分泌毒素致病無莢膜菌落粗糙無毒不致病SⅠSⅡSⅢ三個血清型RⅠRⅡRⅢ三個血清型活死死加活R菌或死S菌加活S菌加活R菌和熱死S菌抽血分離活的S菌轉(zhuǎn)化實驗（1）動物實驗?ＳⅢ〖熱死〗

無菌落生長

體外培養(yǎng)

ＲⅡ〖活菌〗

體外培養(yǎng)

ＲⅡ菌落

ＲⅡ菌落多ＳⅢ菌落少

體外混合培養(yǎng)ＳⅢ〖熱死〗

ＲⅡ〖活菌〗

說明：加熱殺死的S型細菌中可能存在某種物質(zhì)，能通過某種方式進入R型細菌。轉(zhuǎn)化實驗（2）細菌培養(yǎng)實驗大量R菌落活R菌S菌無細胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+說明：遺傳因子是以DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化實驗（3）S型菌無細胞抽提液試驗（二）噬菌體的感染實驗吸附10分鐘后攪動離心上清液沉淀離心,分出上清液和沉淀.沉淀細胞進一步培養(yǎng)，產(chǎn)生大量的子代噬菌體(30%P32、

1%Ｓ35

）。證明：在其DNA中，含有包括Pro外殼在內(nèi)的整套遺傳物質(zhì)。

植物病毒蛋白質(zhì)和RNA可以人為地分開,同時又可把它們重新組合成具感染性的病毒.甲ＲＮＡ＋乙Ｐr→感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒乙ＲＮＡ＋甲Ｐr→感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒（三）植物病毒的重建實驗

TMV:煙草花葉病毒HRV:霍氏車前花葉病毒（RNA)證明遺傳物質(zhì)是RNATMVHRVHRVTMV原始株拆開重建感染分離純化植物病毒的重建實驗

第二節(jié)基因突變及修復(fù)一基因突變二DNA損傷的修復(fù)一基因突變（一）突變類型（二）突變的特點（一）突變類型1堿基變化與遺傳信息的改變2表型變化1堿基變化與遺傳信息的改變（1）錯義突變（missensemutation）：某個密碼的第一個堿基或第二個堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，使編碼某一氨基酸的密碼變?yōu)榫幋a另一個氨基酸的密碼。氨基酸置換（2）無義突變（nonsensemutation）：某個密碼的第一個堿基或第二、第三個堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，變?yōu)椴痪幋a任何氨基酸的密碼。終止密碼子（UAA,UAG,UGA)。（3）同義突變（samesensemutation）：發(fā)生改變的堿基位于密碼的第3位，一般編碼同一個氨基酸。比如簡并密碼。編碼的氨基酸與野生型氨基酸相同。（4）移碼突變（frameshiftmutation）：DNA序列中1-2個核苷酸缺失或插入，翻譯的閱讀框改變，導(dǎo)致氨基酸序列改變。2表型變化（1）營養(yǎng)缺陷型（2）抗藥性突變型（3）條件致死突變型（4）形態(tài)突變型（1）營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)▲由于代謝障礙成為必須添加某種物質(zhì)才能生長的突變株?！汆堰释蛔冎闍de-（完全培養(yǎng)基）腺嘌呤野生型菌株Ade+（基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基）?！鵂I養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標記和育種的重要手段?！糜坝∑桨暹M行分離篩選。完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基（2）抗藥性突變型（resistantmutant)由于基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的一種突變型。在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長?！谀骋粭l件下具有致死效應(yīng)，在另一條件下沒有致死效應(yīng)?！铣申P(guān)鍵性酶的基因發(fā)生了突變?！?/p>

如溫度敏感突變ts（42℃致死，25℃~30℃存活）?！糜坝∑桨暹M行分離篩選。（3）條件致死突變型（conditionallethalmutant）細胞形態(tài)突變菌落形態(tài)突變顏色突變噬菌斑形態(tài)突變（4）形態(tài)突變型（morphologicalmutant）包括（二）突變的特點1非對應(yīng)性：環(huán)境與變異無對應(yīng)性。2自發(fā)性：非人為的誘變因素下發(fā)生。3規(guī)律性：某一特定性的突變率具規(guī)律性。4獨立性：一個基因的突變對其它基因突變無影響。5稀有性：生物自發(fā)突變率為10-6～10-12。6誘變性：誘變劑可提高突變率10~105×。7穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳。8可逆性：有回復(fù)突變。二DNA損傷及修復(fù)（自學(xué)）1光復(fù)活作用（Photoreactivation）2切除修復(fù)（ExcisionRepair）3重組修復(fù)（RecombinationRepair）4SOS修復(fù)（SOSRepair）光復(fù)活作用（Photoreactivation）ThymineDimerPhotoreactivation光解酶Phr在黑暗中專一地識別嘧啶二聚體，并與之結(jié)合，形成酶-DNA復(fù)合物，當有光時，酶利用光能將二聚體拆開，恢復(fù)原狀，酶再釋放出來。正常可見光下光誘導(dǎo)系統(tǒng)的修復(fù)。photoreactivationenzyme光裂合酶photolyase烷基轉(zhuǎn)移酶Alkyltransferases切割嘧啶二聚體，分開。胸腺嘧啶二聚體光復(fù)活酶可見光光的吸收酶的釋放光復(fù)活過程第三節(jié)基因重組一、原核生物的基因重組二、真核生物的基因重組基因重組§把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個體的方式?！旎蛑亟M——分子水平的雜交§一般雜交——細胞水平如：甲乙生長快、產(chǎn)量低生長慢、產(chǎn)量高

基因重組

生長快、產(chǎn)量高一原核微生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transformation)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（三）接合(conjugation)（一）轉(zhuǎn)化（transformation)概念——

受體細胞(receptor)直接吸收來自供體細胞(donor)的DNA片斷，并把它整合到自己的基因組中，細胞部分遺傳性狀發(fā)生變化的現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)化。1.感受態(tài)2.感受態(tài)因子3.轉(zhuǎn)化因子4.轉(zhuǎn)化的特點

（1）感受態(tài)：受體細胞最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。（2）轉(zhuǎn)化的決定因素：不同菌株的親緣關(guān)系;受體細胞是否處于感受態(tài)；不同菌出現(xiàn)感受態(tài)的時間不同。（3）感受態(tài)的獲得：自然獲得；用CaCl2處理細胞；電穿孔1.感受態(tài)細菌自身分泌的一種胞外蛋白質(zhì)，分子量為5～10kD。其作用為：（1）催化轉(zhuǎn)化，促進外來DNA片段吸收。（2）可降解細胞表面某種成分，使DNA受體暴露。§不同菌細胞DNA受體位點不同?！煊械木惺軕B(tài)因子只對同種菌起作用。2.感受態(tài)因子3.轉(zhuǎn)化因子（1）轉(zhuǎn)化因子由供體提供。（2）一般為線狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；雙鏈ＤＮＡ有轉(zhuǎn)化能力，單鏈沒有。（3）自然情況下可由細菌細胞自行裂解產(chǎn)生；實驗室里通過提取獲得。（4）轉(zhuǎn)化的頻率往往很低，一般為0.1～1%。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高。游離的ＤＮＡ片斷叫轉(zhuǎn)化因子。4.轉(zhuǎn)化的特點不需兩個細胞直接接觸，供體DNA提取出來，注入受體即可。在細菌的感受態(tài)出現(xiàn)時，具有從周圍環(huán)境吸收DNA分子而不被DNA酶破壞的生理特性。處于感受態(tài)的細胞，吸收DNA的能力有時可比一般細胞大1000倍。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)以溫和噬菌體為媒介，把供體細胞的DNA或RNA片斷轉(zhuǎn)移到受體細胞中，從而使后者獲得前者的部分遺傳性狀。不需要細胞間直接接觸。但需要媒介。

普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（GeneralizedTransduction）

噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體染色體的任何部分到受體細胞中。

局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（SpecializedTransduction）

噬菌體總是攜帶同樣的片段到受體細胞中。結(jié)果10-5頻率出現(xiàn)野生型菌株。（基本培養(yǎng)基）U型管試驗：也能出現(xiàn)野生型菌株（基本培養(yǎng)基）在對鼠傷寒沙門氏菌營養(yǎng)缺陷型菌株的研究中發(fā)現(xiàn)A+B-A-B+A+B+A+B+供體A-B+A+B-多數(shù)受體形成溶源菌A-B+A+B-少數(shù)受體A+B+經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子A:組氨酸B:色氨酸GeneralizedTransductionSpecializedTransduction▲被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因與噬菌體DNA共價連接，與噬菌體DNA一起進行復(fù)制包裝以及導(dǎo)入受體細胞?！删w攜帶特殊的染色體片段將固定的個別基因?qū)胧荏w。普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同之處：SpecializedTransduction原噬菌體供體DNA受體DNA（三）接合(conjugation)概念：供體細胞與受體細胞直接接觸，借性菌毛傳遞大段DNA的過程。在受體細胞中發(fā)生交換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新性狀的受體細胞就稱接合子。+A+B+C-D-A-B-C+D+接合及其發(fā)現(xiàn)（大腸桿菌）A+B+C+D+A:生物素B:甲硫氨酸C:蘇氨酸D:賴氨酸基本培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+Davis（1950）U型管試驗兩個菌株不能直接接觸，只能是培養(yǎng)液和營養(yǎng)物質(zhì)（包括DNA分子）可以通過。完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+基本培養(yǎng)基沒有菌生長1.F+與F-雜交F+細菌的表面有稱作性菌毛（sexpili）的細長菌毛，由此與F－細菌接合，一旦接觸后，菌毛發(fā)生改變，成為兩細胞間的原生質(zhì)通道----細胞質(zhì)橋或稱結(jié)合管（conjugationtube），F(xiàn)+細胞的F因子通過接合管向F－細胞轉(zhuǎn)遞：使F－變成F＋，F(xiàn)因子還可改變細胞表面的構(gòu)造，以防F＋細胞間的接合。F+細菌：含有F因子F-細菌：不含有F因子F因子就是F質(zhì)粒。滾環(huán)式復(fù)制，σ式2.Hfr×F-雜交Hfr菌的形成——F質(zhì)粒整合到細菌染色體上。質(zhì)粒和染色體共有插入序列和轉(zhuǎn)座因子。這些轉(zhuǎn)座因子之間的同源重組導(dǎo)致質(zhì)粒的整合。Hfr×F-雜交結(jié)果仍是Hfr細胞和F-細胞。Hfr和F+的聯(lián)系和區(qū)別

聯(lián)系：（1）都是雄性菌，含有F質(zhì)粒。（2）Hfr——F質(zhì)粒與染色體整合。

F+

——F質(zhì)粒游離在染色體外。區(qū)別：（1）Hfr

的F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率低，F(xiàn)+

的F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率高；（2）Hfr的F質(zhì)粒整合，F(xiàn)+的F質(zhì)粒游離。3.F’轉(zhuǎn)導(dǎo)F’因子攜帶有宿主染色體基因的F因子。從Hfr菌中染色體上脫離下來的F質(zhì)粒有時會攜帶相鄰的染色體基因或DNA片段，稱為F’質(zhì)粒（F’因子），該菌被稱為F’菌。F’因子§給體的部分染色體基因隨F’一起轉(zhuǎn)入受體細胞?；虿恍枵暇涂杀磉_。§利用F’因子形成部分二倍體叫做性導(dǎo)sexduction。F’×F-雜交注意區(qū)別F+菌、Hfr菌、F’菌的不同！轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合三者的根本區(qū)別

在于DNA轉(zhuǎn)移的方式不同轉(zhuǎn)化：供體DNA片斷→注入受體細胞，通過細胞膜接合：供體進入受體通過性菌毛。轉(zhuǎn)導(dǎo)：供體DNA片斷通過媒介－噬菌體攜帶進入受體。二真核微生物的基因重組（一）有性生殖（二）準性生殖（parasexualhybridization）（三）酵母菌的接合型遺傳（一）有性生殖一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種生殖方式。凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物有性生殖相似的方法進行有性繁殖。一部分真菌的減數(shù)分裂發(fā)生在1個閉合的子囊殼中，具較短的生活周期，為遺傳重組的研究帶來極大方便。子囊孢子形成過程粗糙脈胞霉：1個子囊內(nèi)產(chǎn)生的雙倍體核直接減數(shù)分裂后所產(chǎn)生的4個孢子直線排列在子囊內(nèi)（為順序排列四分體），再進行一次有絲分裂，產(chǎn)生8個子囊孢子。AAAAaaaa、aaaaAAAA、AAaaAAaaaaAAaaAA、AAaaaaAA、aaAAAAaa8個子囊孢子的排列：粗糙脈胞霉（面包霉）的生活史分生孢子（n）菌絲（n）子實體核融合合子核(2n)交配型A交配型B減數(shù)分裂I減數(shù)分裂II有絲分裂萌發(fā)(n)子囊孢子（n）粗糙脈胞霉減數(shù)分裂（二）準性生殖（parasexualreproduction）1.準性生殖2.準性生殖的意義3.過程1準性生殖同種異株的兩個體細胞融合，不經(jīng)減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻基因重組發(fā)生的一種繁殖方式。（單倍體體細胞重組）準性生殖與有性生殖的不同：

▲重組體細胞和一般營養(yǎng)體細胞外形沒有不同，不產(chǎn)生在特殊的囊器中?！旧w的交換及單倍體化過程沒有規(guī)律性。2準性生殖的意義▲對一些沒有有性過程但有重要生產(chǎn)價值的半知菌來說，進行基因在染色體上定性研究、雜交育種，準性生殖提供了一個重要的手段。▲發(fā)現(xiàn)存在于構(gòu)巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放線菌中，使之有普遍意義。3準性生殖的過程（1）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosis）;（2）形成異核體（heterocaryon）;細胞質(zhì)、細胞核交流形成異核菌絲體。（3）核配（caryogamy)形成雜合二倍體;特點：頻率低，10-5～10-7

促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫。（4）體細胞交換和單倍體化異核體同時具有二種或二種以上不同基因型核在同一細胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象又叫異核現(xiàn)象。同核體同一菌絲中只有一種核。

體細胞交換和單倍體化

體細胞交換：

雜合二倍體細胞中有極少數(shù)細胞核在進行有絲分裂的過程中，能發(fā)生體細胞染色體間的交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子。

單倍體化：

在一系列有絲分裂過程中一再發(fā)生的個別染色體減半，直至最后形成單倍體的過程。

（三）酵母菌的接合型遺傳§酵母菌以單倍體或二倍體的狀態(tài)存在。§單倍體：a細胞或α細胞，或稱a接合型，α接合型。§二倍體：a細胞和α細胞融合形成二倍體細胞。§接合型遺傳：a細胞α細胞的轉(zhuǎn)變。盒式機制轉(zhuǎn)變。啟動子沉默狀態(tài)沉默狀態(tài)a基因表達。a型細胞。盒式機制轉(zhuǎn)變在于MAT活性區(qū)的調(diào)控作用第四節(jié)微生物育種一誘變育種

營養(yǎng)缺陷型的篩選三原生質(zhì)體融合一誘變育種1、概念2、誘變劑3.誘變程序4、誘變的主要環(huán)節(jié)1、概念誘變育種是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。2誘變劑（1）概念：凡能提高基因突變頻率的理化因素。

（2）種類：1）物理因子（phisicalagents)

物理誘變劑：U.V、χ、γ、快中子、超聲波等。2）化學(xué)因子(chemicalagents)化學(xué)誘變劑

堿基修飾劑

如：羥胺、氮芥、硫酸二乙酯（DES）、亞硝基胍（NTG）

機制：對堿基做修飾，改變堿基的配對性質(zhì)。堿基類似物

如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）、5-溴尿嘧啶（5-UB）、2-氨基嘌呤（2AP）等。機制：在DNA復(fù)制時將堿基類似物插入DNA中，而堿基類似物存在正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，在DNA復(fù)制時出現(xiàn)突變體。插入劑

(intercalatingagents):

如：溴化乙錠、吖啶橙等一些三環(huán)分子。機制：在形態(tài)上類似于堿基對的扁平分子。它們插入DNA分子的堿基對之間，使其分開，導(dǎo)致DNA在復(fù)制過程中的滑動，引起移碼突變。

與胞嘧啶反應(yīng)，加上羥基（-OH），對胞嘧啶加以修飾。修飾后的胞嘧啶類似胸腺嘧啶T。C—G羥基化的胞嘧啶—A誘發(fā)CG到TA的轉(zhuǎn)換突變堿基修飾劑----羥胺堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）正常狀態(tài)：類似胸腺嘧啶，與腺嘌呤配對。

A—5BUA—T下一輪復(fù)制稀有狀態(tài)：類似胞嘧啶，只與鳥嘌呤配對。

G—5BUG—C下一輪復(fù)制正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)可以相互轉(zhuǎn)換BDNA分子吸收稀有狀態(tài)的5BU

G—5BUA—TDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換成正常狀態(tài)（G—C）（取代G—C）ADNA分子吸收正常狀態(tài)的5BU

A—5BUG—CDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換成稀有狀態(tài)（A—T）（取代A—T）堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）圖示3誘變程序

原始菌種原菌種特性鑒定純化斜面/肉湯培養(yǎng)單孢子/單細胞懸液誘變劑處理計算存活率平板分離觀察形態(tài)變異，挑單菌落移至斜面初篩復(fù)篩小試良種保藏中試4誘變的主要環(huán)節(jié)（1）誘變劑的選擇（2）出發(fā)菌株的選擇（3）單孢子或單細胞懸液的制備（4）設(shè)計和采用效率高的篩選方案和方法

（1）誘變劑的選擇：

1）了解誘變劑的性質(zhì)、作用機理和使用方法。2）處理方式§單一因子處理：先后使用?！鞆?fù)合因子處理：兩種以上因素同時使用、單一因子重復(fù)使用。3）處理劑量：測致死率。方法：平板菌落計數(shù)法一般殺菌率為70%左右。

（2）出發(fā)菌株：

育種的原始菌種應(yīng)具備：

§對誘變劑的敏感性高；

§生產(chǎn)中選育過的自發(fā)變異菌株；

§本身具有一些有利性狀；

§對代謝產(chǎn)物有一定積累；

§已經(jīng)發(fā)生過某些變異。（3）單孢子或單細胞懸液的制備

1）必要性：單細胞可均勻地接觸誘變劑，避免出現(xiàn)不純的菌落——菌種退化。2）制備：物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液。3）方法：三角瓶內(nèi)加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑，用無菌脫脂棉過濾）。4）濃度：細菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml

（4）設(shè)計和采用效率高的篩選方案和方法

1）初篩：平板上做定性、半定量的測定，觀察突變株的生理效應(yīng)范圍。方法

§梯度平板法（抗性菌株）

§紙片法（抗性菌株）

§透明圈法（淀粉酶產(chǎn)生菌株等）

§變色圈法（氨基酸生產(chǎn)菌株）2）復(fù)篩：

較精確的生物化學(xué)分析方法—做搖瓶測定二營養(yǎng)缺陷型的篩選（一）概念（二）篩選方法（三）應(yīng)用（一）概念1.三種遺傳型個體2、篩選用的培養(yǎng)基1三種遺傳型個體（1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：

經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)有機養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。如：Lys-;Bio-（2）野生型(wildtype)：

自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。如：Lys+；Bio+（3）原養(yǎng)型(prototroph)：

指auxo突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。2篩選用的培養(yǎng)基1）基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM）[-]：

僅能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的培養(yǎng)基。2）完全培養(yǎng)基（completemedium,CM）[+]：

滿足一切auxotroph生長的天然或半組合培養(yǎng)基。3）補充培養(yǎng)基（supplementedmedium,SM）[x]：

在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)auxotroph生長的組合培養(yǎng)基。（二）篩選方法auxotroph的篩選程序：篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型、檢出和鑒定營養(yǎng)缺陷型四個環(huán)節(jié)。

細菌培養(yǎng)離心洗滌誘變處理在CM上培養(yǎng)洗滌

MM培養(yǎng)（加青霉素等篩選劑）涂布于CM平板影印培養(yǎng)挑取鑒定菌種保存。完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基（三）auxotroph的應(yīng)用（1）作為標記菌株：研究代謝、菌種雜交、重組育種和利用基因工程進行育種時帶有特定基因標記的親本菌。（2）作為生產(chǎn)菌種：氨基酸、核苷酸等生產(chǎn)菌種；（3）作為氨基酸、維生素、堿基等物質(zhì)生物測定的實驗菌種。三原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）§使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusant）的過程?！煲殉晒Φ貞?yīng)用于真菌細胞和植物細胞的屬間和科間的遠緣細胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細胞基因組。1原生質(zhì)體的制備2原生質(zhì)體融合和再生3融合子的選擇1原生質(zhì)體的制備1）選擇兩個親本菌株。

細菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蝸牛酶。2）酶處理破壞細胞壁，使原生質(zhì)流出。制備用培養(yǎng)基：高滲緩沖液或培養(yǎng)基。2原生質(zhì)體融合和再生1）原生質(zhì)體融合

化學(xué)因子誘導(dǎo)：聚乙二醇（polyethyeneglycol，PEG）

并加入Ca2+、Mg2+等陽離子電場誘導(dǎo)：電極極化原生質(zhì)體成偶極子，沿電力線排列成串，電流脈沖，原生質(zhì)體膜被擊穿，融合。2）原生質(zhì)體再生

在再生培養(yǎng)基上再生。再生率0.幾%~幾%.3融合子的選擇營養(yǎng)缺陷型標記選擇依靠在選擇培養(yǎng)基上的遺傳標記，有兩個遺傳標記互補，可確定為融合子?？顾幮詷擞?。第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯及保藏一、菌種的衰退和復(fù)壯

二、菌種保藏一、菌種的衰退和復(fù)壯（一）衰退（二）防止衰退的方法（三）菌種的復(fù)壯（一）衰退1、概念：菌種經(jīng)長期的人工培養(yǎng)或保藏,在其自發(fā)突變的影響下，引起某些優(yōu)良性狀變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象，稱為衰退。2、現(xiàn)象（1）菌落和細胞形態(tài)的改變；（2）生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；（3）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降；（4）抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等?；蜇撏蛔儭焕蛔儯?）多次傳代造成負突變數(shù)量增加

如斜面保藏——細菌：1個月酵母菌：3個月放線菌、霉菌、芽孢：半年（2）培養(yǎng)條件；（3）誘變時出現(xiàn)不純菌落。3、衰退的原因（二）防止衰退的方法1、控制傳代次數(shù)；2、選擇合適的培養(yǎng)條件；3、采用不同類型的細胞進行傳代；4、采用有效的菌種保藏方法。（三）菌種的復(fù)壯1復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀的方法。2復(fù)壯的方法：

（1）純種分離：菌落純（劃線法、涂布法、傾注法）菌株純（單細胞挑取法）（2）通過寄主體進行復(fù)壯；（3）淘汰已衰退的個體。二、菌種保藏（一）目的（二）原理（三）方法（一）目的1、存活，不丟失，不污染2、防止優(yōu)良性狀喪失3、隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種