兩蟲方法確認材料

兩蟲方法確認材料生活飲用水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的測定免疫磁分離熒光抗體法測定方法驗證報告（GB/T5750.12-2006）1.目的通過能力確認，確認實驗室檢出限、回收率，方法重復性方面是否都達到標準要求，實驗室是否具備開展用免疫磁分離熒光抗體檢測定生活飲用水及水源水的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測能力。2.適用范圍本標準規(guī)定了用免疫磁分離熒光抗體法測定生活飲用水及水源水中的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲（以下簡稱為“兩蟲”）的含量。本標準適用于生活飲用水及水源水中的“兩蟲”的測定。3.職責3.1檢測人員負責按操作規(guī)程操作，確保測量過程正常進行，消除各種可能影響試驗結果的意外因素。3.2復核人員負責檢查原始記錄。3.3技術負責人負責審核檢測結果。4.測試方法4.1術語和定義賈第鞭毛蟲（Giardia）：一種可能在水中或其他介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的原蟲類寄生蟲。有兩個種，宿主是：G.intestinalis（人類）和G.muris（鼠類）。隱孢子蟲（cryptosporidium）：一種可能在水中或其他介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的原蟲類寄生蟲，有6個種哺乳類動物，包括人類；鳥類；鼠類；爬行類和魚類。4.2．試劑4.2.1EasyseedG/C質(zhì)控標樣（賈第鞭毛蟲孢囊100±1.6，隱孢子蟲卵囊100±1.2）；4.2.2挪威Dynal賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲免疫磁分離試劑盒；4.2.3美國Waterborne賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲染色試劑盒；4.2.4PBS緩沖溶液：NaCl，8g；KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.24g；純水，1000mL，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至7.2±0.1，在4℃可存儲1個星期。4.2.5PBST淘洗緩沖液：NaCl，8g；，KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.2g；TWeen-20，0.1mL；純水1000mL，將磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉加入到900mL超純水，攪拌20min至完全溶解，加入0.1mLTween-20并繼續(xù)攪拌10min，然后用超純水稀釋至1000mL；mol/LHCl；4.2.71mol/LNaOH；4.2.8去離子水4.3器材DynalMPC-1磁極、DynalMPC-S磁極、DynalMX1混合器、FMxpressV2.0快速淘洗裝置系統(tǒng)、蠕動泵、IKA渦旋震蕩混混合器、空氣壓縮機、四川蜀科離心機、DynalL10試管、BK-FL正置熒光顯微鏡、移液槍。4.3檢驗步驟4.3.1水樣過濾/淘洗/濃縮過程（Filta）采樣體積原水20L，處理水100L；根據(jù)水樣類型決定。將過濾模塊（螺栓頭朝下）安裝在支架上，擰緊蓋子（蓋子即為進樣口）。將過濾裝置連接到需采樣的水源。中間連接上蠕動泵及流量控制閥4L/min。開動泵，根據(jù)水樣量來確定采樣時間，記下過濾后水的體積V2，單位為L。淘洗打開壓力淘洗器，過濾裝置進樣口朝上，移開樣品阻留器，連接出樣口分流裝置。將過濾裝置倒轉，用快接頭連接到壓力淘洗器上，連接盛有緩沖液的瓶子，加4.0巴壓縮空氣，。并將500mL錐形離心瓶放置在樣品收集器支架上，關閉壓力淘洗裝置。淘洗裝置按控制面板的F1鍵，開始自動淘洗，2min后收集約500mL的淘洗液。濃縮將裝有淘洗液樣本的500mL離心管置2000g離心機離心15min，慢慢減速，并記錄下沉淀物體積V0。將沉淀物上層8mL～10mL處的懸浮物小心吸出。4.3.2免疫磁分離（IMS）使用賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲免疫磁分離試劑盒中的試劑制備1×SL-A型緩沖液，用試劑水作為稀釋劑。加1mL10×SL-A型緩沖液和1mL10×SL-B型緩沖液到L10單平面試管中。定量轉移10mL(V1)水樣濃縮物再懸浮液到含有SL-緩沖液的L10單平面試管中。將抗隱孢子蟲抗體和抗賈第鞭毛蟲的磁微粒原液置于DynalMX1混合器上攪拌，以便使珠粒懸浮。并在上述L10單平面試管中各加入100μL上訴述懸浮的微粒。將樣品試管固定到DynalMX1混合器，在25r/min的條件下至少旋轉1h。將試管從攪拌器上取下，然后將其放在磁力濃縮器（MPC-1）上，收集磁珠，棄去清液。將試管從MPC-1上取下，加1mL1×SL-A型緩沖溶液。非常柔和的將試管中的所有物質(zhì)再懸浮。將樣品試管中的的所有液體定量轉移到貼有標簽的1.5mL微量離心管中。將微量離心管放到另一磁粒子濃縮器（MPC-S)中，對磁珠進行濃縮，再次純化，并吸走上清液。加入50μL0.1mol/L的鹽酸（HCl）至上述微量離心管中，用DynalMX1混合器混合10s，使磁珠與孢（卵)囊充分解離。準備一個井型載玻片，然后加5μL1mol/L的氫氧化鈉溶液至樣本井中。將所有樣品從MPC-S的微量離心管中轉移到有氫氧化鈉的樣品井中。4.3.3染色與鏡檢(FA)將有樣品的井型載玻片放到37℃的培養(yǎng)箱中，蒸發(fā)干，在每一含有干樣品的井中滴加50μL純甲醇，然后讓它空干3min～5min。加50μL上述異硫氰酸熒光素（FITC）單克隆抗體工作稀釋液至樣本井中。將載玻片放到溫室中于37℃培養(yǎng)30min左右。之后，取出載玻片，然后用一個干凈的巴斯德移液管輕輕地從每個井邊吸掉過量的熒光素標記單克隆抗體。在每個井中加70μL的PBS（或者WashBuffer稀釋液），靜置1min～2min后，吸掉多余的PBS。加50μLDAPI溶液（使用時配制，即加10μL，2mg/mL溶于甲醇的DAPI于50mL的PBS中）到每個井中，然后讓它在室溫靜止2min左右，吸掉過量的DAPI溶液。加７０μL的WashBuffer稀釋液到每個井中，靜置1min～2min后，吸掉多余的PBS。加70μL的試劑水到每個井中，靜止1min后，吸掉多余的水分。讓載玻片在暗處干燥后，加一滴含防熒光減弱的封固劑到每個井的中心，在井型載玻片上蓋上載玻片，準備鏡檢觀察。注意１：為確保染色過程準確可靠，進行染色試劑陰性對照和陽性對照試驗。陰性對照：用純水進行染色試驗；陽性對照：用試劑盒中自帶的陽性樣本進行染色試驗。打開顯微鏡和汞燈。預熱10min后，在200倍的熒光顯微鏡下檢查，在400倍的熒光顯微鏡下進一步證實。全井計數(shù)X，即計數(shù)樣本的體積中孢囊或卵囊的數(shù)目。結果判斷依據(jù)如下表。（在對樣品進行計數(shù)前，要先計數(shù)陰性和陽性對照實驗樣品；陰性樣品不得檢出任何的“兩蟲”，陽性樣品中要檢出特征正常、規(guī)則、染色均勻、數(shù)量正常的“兩蟲”）。賈第鞭毛蟲的孢囊是橢圓形的，長度為8～14μm，寬度為7～10μm會發(fā)出蘋果綠的熒光，在紫外光下，DAPI陽性孢囊會出現(xiàn)4個亮藍色的核。隱孢子蟲的卵囊為微橢圓形，直徑2～6μm，卵囊壁會發(fā)出蘋果綠的熒光，在紫外光燈下，DAPI陽性孢囊會出現(xiàn)4個亮藍色的核。表1賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊陽性判斷5.檢出限、回收率和精密度5.1檢出限5.1.1檢出限方法：直接處理100L處理水，按照4.3的檢驗步驟進行測定，其中結果見附表1，由檢測限計算公式：D=V/(V1×V2)得處理水的“兩蟲”檢測限為：D=10mL/（10mL×100L）=0.1個/10L水源水的“兩蟲”檢出限為：D=10mL/（10mL×20L）=0.5個/10L5.2回收率和精密度在10L蒸餾水中攙加一劑EasyseedG/C質(zhì)控標樣（賈第鞭毛蟲孢囊100±1.6，隱孢子蟲卵囊100±1.2）兩蟲質(zhì)控標樣，用磁力攪拌器混勻10min后，進行過濾，待10L原蟲水基本全部過濾完后，再加10L的水到10L玻璃瓶中，后繼續(xù)過濾水樣。總過濾體積為20L，再按照淘洗、濃縮、磁分離、染色、鏡檢的分析過程進行檢測，重復做4次，結果見附表。（1）由平均值公式得∑==n1ixn1xi，賈第鞭毛蟲平均回收率為x=（31%+42%+38%+45%）/4=39%隱孢子蟲平均回收率x=（29%+39%+43%+41%）/4=38.0%陽性陽性陽性確認為卵囊或孢囊陽性陽性陰性確認為卵囊或孢囊陽性陰性陽性確認為卵囊或孢囊陽性陰性陰性懷疑為卵囊或孢囊陰性陰性陰性無卵囊或孢囊檢出（2）由標準偏差公式1)(12--=∑=nxxSDnii得：賈第鞭毛蟲標準偏差SD=0.06隱孢子蟲標準偏差SD=0.06（3）由相對標準偏差%100?=xSDRSD得；賈第鞭毛蟲相對標準偏差RSD=0.06/39.0%=15.5