口蹄疫液相阻斷

演示文稿口蹄疫液相阻斷現(xiàn)在是1頁\一共有18頁\編輯于星期三（優(yōu)選）口蹄疫液相阻斷現(xiàn)在是2頁\一共有18頁\編輯于星期三一、液相阻斷ELISA基礎(chǔ)知識液相阻斷ELISA（LB-ELISA）通途：1、檢測口蹄疫感染，廣泛用于國際貿(mào)易中，是OIE指定方法之一；2、監(jiān)測牛、羊和豬等偶蹄動物血清中口蹄疫免疫效價，評價口蹄疫疫苗免疫效果。現(xiàn)在是3頁\一共有18頁\編輯于星期三BL-ELISA原理圖待檢血清與病毒抗原混合液捕獲抗體檢測抗體病毒酶結(jié)合物顯色液陽性不顯色陰性顯黃色現(xiàn)在是4頁\一共有18頁\編輯于星期三BL-ELISA反應(yīng)原理：將預(yù)先滴定好的病毒抗原與被檢血清首先在液相中反應(yīng)，然后將抗原抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到包被了口蹄疫特異性抗體的ELISA板中，沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被ELISA板中的抗體捕獲，再通過酶結(jié)合物與底物顯色。按照實驗孔呈現(xiàn)顏色與抗原對照（未加血清）孔呈現(xiàn)顏色相比較判定結(jié)果。抗體滴度以阻斷50%病毒抗原的血清稀釋度表示?，F(xiàn)在是5頁\一共有18頁\編輯于星期三二、實驗前準(zhǔn)備1、使用前，試劑盒所有組份應(yīng)回復(fù)到18-26℃，試劑要混合均勻，每個樣品使用一個吸頭。2、濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋?，F(xiàn)在是6頁\一共有18頁\編輯于星期三三、實驗操作步驟1、抗原抗體反應(yīng)布板現(xiàn)在是7頁\一共有18頁\編輯于星期三圖2

96孔酶標(biāo)板檢測20份樣品布局圖S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S1

1:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:512病毒抗原1:641:10241:1281:20481:2561:4096現(xiàn)在是8頁\一共有18頁\編輯于星期三1.1稀釋病毒抗原：用配制好的洗滌液在孔外6倍稀釋病毒抗原。1.2待檢血清稀釋：在血清稀釋板上，使用洗滌液連續(xù)2倍稀釋每份被檢血清，每份血清稀釋2-8孔，根據(jù)檢測用途而定。使每孔最終量都為50vl。1.3稀釋陽性對照，參照步驟1.2，連續(xù)2倍稀釋，從1：16-1：1024。1.4稀釋陰性對照，參照步驟1.2，連續(xù)2倍稀釋，從1：2-1：4。現(xiàn)在是9頁\一共有18頁\編輯于星期三1.5血清稀釋板加樣：使用稀釋好的病毒抗原加樣，其中預(yù)設(shè)的4孔病毒抗原對照孔按100vl/孔加入，其余待檢血清、陰陽性對照按50vl/孔加入。加樣完畢，所有樣品孔和因陽性對照孔稀釋度翻倍，變?yōu)閳D1圖、2所示。1.6將加好樣的血清稀釋板封板，置于37℃反應(yīng)2h。現(xiàn)在是10頁\一共有18頁\編輯于星期三2、樣抗原抗體混合液及病毒抗原對照從血清稀釋板上按次序轉(zhuǎn)移到包被板上50vl/孔，封板，37℃反應(yīng)30Min。3、洗滌液洗版5次，拍干。加抗體溶液50vl/孔，封板，37℃反應(yīng)35Min。4、同上洗板5次，拍干。加酶結(jié)合物50vl/孔，封板，37℃反應(yīng)35Min。現(xiàn)在是11頁\一共有18頁\編輯于星期三5、同上洗板5次，拍干，50vl/孔加入底物溶液（顯色液A和B按1：1混合），37℃避光溫育15min。6每孔再加50vl終止液終止反應(yīng)，立即在450nm波長下讀取OD值?，F(xiàn)在是12頁\一共有18頁\編輯于星期三現(xiàn)在是13頁\一共有18頁\編輯于星期三四、結(jié)果分析1、實驗成立條件病毒抗原對照OD值應(yīng)在2.0±1范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價應(yīng)在1：1024±1滴度范圍內(nèi)。陰性對照抗體效價應(yīng)＜1：8.如果實驗無效，實驗中的操作值得懷疑，最好重新作一遍?，F(xiàn)在是14頁\一共有18頁\編輯于星期三2、結(jié)果判定抗原對照4孔，棄去1個最高和最低值，計算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即50%對照值，該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對照OD450值。備檢血清OD450值＞臨界值，判為陰性；備檢血清OD450值≤臨界值，判為陽性；現(xiàn)在是15頁\一共有18頁\編輯于星期三每份血清系列滴度稀釋中，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該備檢血清的抗體效價。若臨界值處于2孔之間，抗體效價取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數(shù)的反對數(shù)中間值，如果處在1：64和1:128之間，則該份血清抗體效價是1：90。定性檢測時，兩個孔只有一個孔為陽性，則抗體滴度為1：128，2孔均為陽性，則抗體效價＞1：128.現(xiàn)在是16頁\一共有18頁\編輯于星期三抗體效價≥1：128，判為陽性；抗體效價≤1：64，判為陰性；抗體效價在1：64-1：128之間，判為可疑；可以血清需要復(fù)檢，復(fù)檢抗體效價≥1：128，判為陽性；抗體效價≤1：64，判為陰性；現(xiàn)在是17頁\一共有18頁\編輯于星期三五、注意事項1、實驗前必須認