單克隆抗體的制備和應(yīng)用

單克隆抗體的

制備和應(yīng)用基礎(chǔ)部免疫教研室金伯泉現(xiàn)在是1頁\一共有59頁\編輯于星期四20世紀(jì)有關(guān)抗體的生理學(xué)和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎項獲獎年代學(xué)者獲獎成就1901E.A.Behring發(fā)現(xiàn)抗毒素，開創(chuàng)免疫血清療法1908P.Ehrlich抗體生成的側(cè)鏈學(xué)說E.Metchnikoff細(xì)胞吞噬作用1913C.Richet發(fā)現(xiàn)過敏現(xiàn)象1960F.M.Burnet抗體生成的克隆選擇學(xué)說P.B.Medawar1972G.M.Edelman抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)R.M.Porter1977R.S.Yalow創(chuàng)立放射免疫測定法1984G.K?hlerB細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體C.MilsteinN.Jerne免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說1987Tonegawa抗體多樣性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)現(xiàn)在是2頁\一共有59頁\編輯于星期四NielsK.JerneGeorgesJ.F.K?hlerCésarMilstein現(xiàn)在是3頁\一共有59頁\編輯于星期四B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)是如何創(chuàng)立的應(yīng)用SRBC為免疫原免疫小鼠為模型,觀察抗體產(chǎn)生細(xì)胞的體細(xì)胞突變(Somaticmutation)Hybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495導(dǎo)致了在生命科學(xué)領(lǐng)域中的一場革命現(xiàn)在是4頁\一共有59頁\編輯于星期四克?。–lone）又名無性繁殖系，指由一個祖

先細(xì)胞經(jīng)分化、增殖所產(chǎn)生的遺傳性狀完全相

同的細(xì)胞群

現(xiàn)在是5頁\一共有59頁\編輯于星期四多克隆抗體（Polyclonalantibody,pAb）

用包含多種抗原決定基的抗原物質(zhì)免疫動

物，從而刺激多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對多種抗

原表位的不同抗體的總和，稱為多克隆抗體單克隆抗體（MonoclonalAntibody,mAb）

由一個雜交瘤細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的，針對單一抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體現(xiàn)在是6頁\一共有59頁\編輯于星期四單克隆抗體的優(yōu)點單特異性和均一性無限供應(yīng)用混合的抗原制備出識別一個抗原決定簇的抗體McAbPcAb現(xiàn)在是7頁\一共有59頁\編輯于星期四雜交細(xì)胞（hybridcell）

在外界某些條件干預(yù)下（如PEG、電穿孔），當(dāng)兩個細(xì)胞緊密地接觸的時候,其細(xì)胞膜可能發(fā)生融合，產(chǎn)生具有原來兩個細(xì)胞染色體/基因的單個細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞

現(xiàn)在是8頁\一共有59頁\編輯于星期四雜交瘤細(xì)胞（Hybridomas）

若用一種腫瘤細(xì)胞與另一種體細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）融合，所形成的雜交細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞，簡稱雜交瘤。其既具有腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力，也具有淋巴細(xì)胞的一些特性

B淋巴細(xì)胞雜交瘤

骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞現(xiàn)在是9頁\一共有59頁\編輯于星期四B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的基本原理B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞現(xiàn)在是10頁\一共有59頁\編輯于星期四抗原制備免疫動物骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化單克隆抗體的鑒定單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的主要步驟現(xiàn)在是11頁\一共有59頁\編輯于星期四一、抗原細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等，一般具有較強(qiáng)的免疫原性，可不加佐劑。例如，直接腹腔注射1~2×107個細(xì)胞。顆粒性抗原：可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？扇苄钥乖枧c弗氏完全或不完全佐劑混勻，進(jìn)行免疫。可溶性抗原：現(xiàn)在是12頁\一共有59頁\編輯于星期四B淋巴細(xì)胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，有利于細(xì)胞融合形成分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。多次免疫可通過抗體親和力成熟機(jī)制，使B細(xì)胞分泌高親和力抗體，由此形成的雜交瘤往往可分泌高親和力抗體，有更高的應(yīng)用價值。

二、免疫動物免疫目的：現(xiàn)在是13頁\一共有59頁\編輯于星期四采用與骨髓瘤供體同一品系的動物

免疫動物品系（脾細(xì)胞供體）和骨髓瘤細(xì)胞

在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)則產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，獲得的雜交瘤不能在該品系小鼠體內(nèi)誘生腹水。動物的選擇：動物對抗原刺激易產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)8~12周齡雌性小鼠（最常用BALB/c）現(xiàn)在是14頁\一共有59頁\編輯于星期四第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后檢測血清效價加強(qiáng)免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠腹腔注射細(xì)胞融合3天后免疫程序：現(xiàn)在是15頁\一共有59頁\編輯于星期四

脾（spleen）抗原脾（spleen）現(xiàn)在是16頁\一共有59頁\編輯于星期四所選擇的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)與提供免疫脾細(xì)胞的動物

品系相同三、骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備骨髓瘤細(xì)胞系的選擇要點：自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈與輕鏈對氨基碟呤敏感與免疫脾細(xì)胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌Ig雜交瘤細(xì)胞現(xiàn)在是17頁\一共有59頁\編輯于星期四飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞小鼠脾細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）：增加細(xì)胞密度，滿足新生的雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的要求吞噬清除死亡的細(xì)胞分泌生長刺激因子促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長飼養(yǎng)細(xì)胞的種類和制備方法：現(xiàn)在是18頁\一共有59頁\編輯于星期四四、細(xì)胞融合融合前的準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備HAT、HT培養(yǎng)液、融合劑PEG準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備免疫脾細(xì)胞現(xiàn)在是19頁\一共有59頁\編輯于星期四拉頸處死小鼠無菌操作取出脾臟清洗、研磨收集細(xì)胞離心洗滌細(xì)胞計數(shù)脾細(xì)胞的準(zhǔn)備現(xiàn)在是20頁\一共有59頁\編輯于星期四收集細(xì)胞離心洗滌活細(xì)胞計數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備現(xiàn)在是21頁\一共有59頁\編輯于星期四細(xì)胞融合

骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按一定比例混合1:10或1:5加入促融劑PEGPEG現(xiàn)在是22頁\一共有59頁\編輯于星期四在聚乙二醇作用下B淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞現(xiàn)在是23頁\一共有59頁\編輯于星期四五、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)HAT選擇性培養(yǎng)的原理：細(xì)胞的DNA生物合成有主要途徑和補償途徑。當(dāng)有氨基碟呤存在時，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，需通過補償途徑合成DNA，這時就需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）利用次黃嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA?，F(xiàn)在是24頁\一共有59頁\編輯于星期四現(xiàn)在是25頁\一共有59頁\編輯于星期四用于雜交瘤融合的骨髓細(xì)胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT和TK，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的B淋巴細(xì)胞雖具有HGPRT和TK，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的能力，又從免疫B細(xì)胞得到HGPRT和TK的基因產(chǎn)物，因此，能夠克服氨基碟呤的阻斷作用，通過次黃嘌呤的補償途徑合成DNA，而在HAT選擇培養(yǎng)液中生長繁殖?，F(xiàn)在是26頁\一共有59頁\編輯于星期四現(xiàn)在是27頁\一共有59頁\編輯于星期四融合后3~4天后，可見外形似骨髓瘤細(xì)胞，渾圓透亮的克隆。融合后第7~9天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。細(xì)胞生長情況

現(xiàn)在是28頁\一共有59頁\編輯于星期四六、雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化雜交瘤分泌單克隆抗體的檢測方法免疫酶技術(shù)——間接ELISA

包被抗原、培養(yǎng)上清、酶標(biāo)抗體、加底物顯色

陰性對照：骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清

陽性對照：免疫鼠血清

免疫熒光技術(shù)間接免疫熒光（或酶）測定法：靶細(xì)胞鋪片、固定細(xì)胞、加待測樣品、加熒光標(biāo)記抗體（或加酶標(biāo)抗體和顯色底物）、鏡檢活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)：流式細(xì)胞術(shù)分析現(xiàn)在是29頁\一共有59頁\編輯于星期四現(xiàn)在是30頁\一共有59頁\編輯于星期四雜交瘤細(xì)胞的克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化?？寺』窗雅囵B(yǎng)孔中的細(xì)胞從單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達(dá)到均一性?，F(xiàn)在是31頁\一共有59頁\編輯于星期四有限稀釋法現(xiàn)在是32頁\一共有59頁\編輯于星期四軟瓊脂培養(yǎng)法以適當(dāng)濃度雜交瘤細(xì)胞加入軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成由一個細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集落?，F(xiàn)在是33頁\一共有59頁\編輯于星期四雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選：現(xiàn)在是34頁\一共有59頁\編輯于星期四免疫球蛋白類別及亞類的鑒定

七、單克隆抗體的鑒定小鼠免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，其分泌的特異性McAb的本質(zhì)仍是小鼠的不同類型及其亞類的免疫球蛋白（Ig），其中以IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3等亞類）最常見，其次為IgM?，F(xiàn)在是35頁\一共有59頁\編輯于星期四抗體親和力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的強(qiáng)度，其高低主要是由抗體分子結(jié)合表位部位和抗原決定簇之間的互補程度決定。特異性是否與其他抗原有交叉反應(yīng)敏感性對腹水和培養(yǎng)上清進(jìn)行效價測定親和力測定現(xiàn)在是36頁\一共有59頁\編輯于星期四八、單克隆抗體的制備

動物體內(nèi)誘生法

取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1~2周后,腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體現(xiàn)在是37頁\一共有59頁\編輯于星期四約1~2周,可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體?，F(xiàn)在是38頁\一共有59頁\編輯于星期四

將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶（或灌）中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體。收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體，不含無關(guān)Ig，但成本髙。體外培養(yǎng)法現(xiàn)在是39頁\一共有59頁\編輯于星期四我國單克隆抗體的發(fā)展歷史和前景早期研究階段全軍單克隆抗體研究協(xié)作組（單克隆抗體通迅）應(yīng)用和市場化HLDA

HCDM功能基因組研究中的重要地位國家重大科技項目（973、863等）主要研究內(nèi)容之一現(xiàn)在是40頁\一共有59頁\編輯于星期四單克隆抗體的應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究（生命科學(xué)）發(fā)病機(jī)理的研究疾病的預(yù)防（緊急預(yù)防）疾病的診斷（傳染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、過敏性疾病、免疫缺陷?。┘膊〉闹委煟ㄖ委熜钥贵w）

——一項重要的生物技術(shù)和一類生物高科技產(chǎn)品現(xiàn)在是41頁\一共有59頁\編輯于星期四單克隆抗體在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用從醫(yī)學(xué)到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用從診斷到預(yù)防和治療MHC細(xì)胞表面分子血型腫瘤相關(guān)抗原和分子抗Ig的同種異型激素、細(xì)胞因子和血漿成分純化干擾素病原生物現(xiàn)在是42頁\一共有59頁\編輯于星期四

傳染性疾病

HIV:急性感染期和晚期:核心抗原p24升高;檢測抗HIV抗體初篩;免疫印跡進(jìn)一步確認(rèn);CD4+T細(xì)胞<200/l病情嚴(yán)重

HAV、HBV、HCV:抗體

HFRS:免疫熒光，ELISA（特異性IgM）

腫瘤

多種腫瘤的標(biāo)志物

直腸結(jié)腸癌:CEA

前列腺癌:PSA原發(fā)性肝癌:AFP淋巴瘤和白血病:CD分子

自身免疫性和過敏性疾病自身抗體（抗核抗體、類風(fēng)濕因子）放射免疫測定法（RIA）檢測特異性IgE

甲狀腺素、胰島素、生長激素

其他

血型檢測：凝集反應(yīng)（直接和間接）早孕:人絨毛膜促性腺激素（hCG）男性不育:抗精子抗體單克隆抗體在臨床診斷中應(yīng)用現(xiàn)在是43頁\一共有59頁\編輯于星期四FabmurineantibodychimericmouseantibodyFvdAbengineeredbispecificAbScFvHumanizedF(ab)2HumanizedantibodyScFv-toxinintrabody現(xiàn)在是44頁\一共有59頁\編輯于星期四NumberoftherapeuticmAbsenteringclinicalstudyperyear現(xiàn)在是45頁\一共有59頁\編輯于星期四TherapeuticcategoriesformAbsinclinicalstudy現(xiàn)在是46頁\一共有59頁\編輯于星期四通用名批準(zhǔn)時間類型識別抗原適應(yīng)癥Muromonab-CD31986mouseCD3急性腎移植移植排斥Daclizumab;Basiliximab1997;1998humanized/chimericIL-2R(CD25)急性腎移植移植排斥Rituximab;Tositumomab;Ibritumomab1997;2002;2003mouse/chimericCD20B細(xì)胞-非何杰金氏淋巴瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Alemtuzumab2001humanizedCD52慢性B淋巴細(xì)胞性白血病Gemtuzumabozogamicin2000chimericCD33急性粒細(xì)胞性白血病Edrecolomab*1995mouseEP-CAM結(jié)、直腸癌Trastuzumab1998humanizedHER-2HER-2過表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌Cetuximab2004humanizedEGFR轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、頭頸部癌癥Bevacizumab2004;2006humanizedVEGF轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌,年齡相關(guān)性黃斑病變Infliximab1998;2002chimeric/humanTNF-α節(jié)段性回腸炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,銀屑病性關(guān)節(jié)炎;強(qiáng)直性脊柱炎Efalizumab2003humanizedCD11a銀屑病Natalizumab2004humanα4整合素多發(fā)性硬化癥Omalizumab2003humanizedIgE過敏性哮喘Abciximab1994chimericGPⅡb/Ⅲa冠心病血小板Palivizumab1998humanizedRSV呼吸道合胞病毒感染現(xiàn)在是47頁\一共有59頁\編輯于星期四CharacteriztionofmAbsagainstEpCAMbyIHC

andIF現(xiàn)在是48頁\一共有59頁\編輯于星期四腫瘤

器官移植排斥自身免疫性疾病其他CD20,CD52,CD33,HER-2EGFR,VEGF,EP-CAMCD3,IL-2R（CD25）TNF-α,CD11a,α4整合素,CD20

GPⅡb/Ⅲa,IgE,RSVgpF現(xiàn)在是49頁\一共有59頁\編輯于星期四MechanismsofmAb-mediatedkilling現(xiàn)在是50頁\一共有59頁\編輯于星期四

CD20

表達(dá)于B淋巴細(xì)胞，其抗體可促進(jìn)細(xì)胞對化療的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、ADCC、CDC

CD33

表達(dá)于90%以上的急性髓樣白血病(AML)細(xì)胞，但不表達(dá)于骨髓CD34+造血干細(xì)胞，其抗體可誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂和細(xì)胞死亡

CD52

可誘導(dǎo)ADCC和CDC，治療慢性B淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞白血病和T細(xì)胞淋巴瘤白血病及淋巴瘤現(xiàn)在是51頁\一共有59頁\編輯于星期四

抗HER2/CD340ADCC，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管形成

抗EGFR

阻斷EGFR與EGF結(jié)合，誘導(dǎo)ADCC，抑制細(xì)胞增殖，抑制腫瘤血管形成，誘導(dǎo)凋亡

抗VEGF阻斷VEGF與VEGF受體結(jié)合，抑制腫瘤的血管生長和轉(zhuǎn)移部位的發(fā)展實質(zhì)性腫瘤現(xiàn)在是52頁\一共有59頁\編輯于星期四

抗CD3

補體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC），清除T細(xì)胞，阻斷T細(xì)胞功能

抗CD25補體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC），阻斷IL-2受體預(yù)防腎移植急性排斥反應(yīng)現(xiàn)在是53頁\一共有59頁\編輯于星期四

抗TNF

阻斷TNF-與受體結(jié)合,降低或消除由TNF-刺激細(xì)胞所發(fā)生的炎癥反應(yīng)

抗CD11a抑制LFA-1與配體結(jié)合,抑制白細(xì)胞黏附,治療斑狀牛皮癬

抗4整合素

抑制VLA-4與配體結(jié)合,抑制白細(xì)胞黏附

CD20治療RA自身免疫性疾病現(xiàn)在是54頁\一共有59頁\編輯于星期四

抗IgE

阻斷IgE與IgE受體結(jié)合,抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒和釋放介質(zhì)，治療持續(xù)性哮喘

抗gpⅡb/Ⅲa

抑制血小板凝血，止血，預(yù)防冠狀動脈血管形成術(shù)中血栓

抗RSVgpF

中和病毒，抑制病毒融合和復(fù)制，預(yù)防兒童在高危期RSV感染其他疾病現(xiàn)在是55頁\一共有59頁\編輯于星期四抗IgEmAb治療過敏性疾病的信號傳導(dǎo)途徑現(xiàn)在是56頁\一共有59頁\編輯于星期四通用名類型識別抗原治療疾病CatumaxomabRomovab雙特異性anti-CD3/Epcam結(jié)腸癌ZanolimumabHumax-CD4人抗體,IgGCD4皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤EpratuzumabLymphocide人源,IgG1CD22非何杰金淋巴瘤和某些自身免疫性疾病(如SLE),與CD20mAb聯(lián)用可能會提高臨床效果MDX-010ipilimumab人抗體,IgGCTLA-4黑素瘤WX-G250Rencarex嵌合,IgG1抗碳酸酐酶Ⅸ晚期腎癌AMG-162denosumab人抗體,IgG2RANKL絕期后骨質(zhì)疏松癥和防止治療腫瘤過程中激素部分切除治療引起的骨丟失Anti-MRSAmAbAurograb人抗體,scFv抗甲氧芐青鏈素的金黃色葡萄球菌(MRSA)金黃色葡萄球菌感染PexelizumabAlexion;Eculizumab人源,單鏈可變區(qū),scFv補體C5治療心血管術(shù)后合并癥,膜性腎炎,急性心肌梗塞,RAMepolizumab人源,IgG1IL-5特應(yīng)性皮炎,嗜酸細(xì)胞過多綜合征FDA批準(zhǔn)進(jìn)入Ⅲ期臨床驗證的治療性抗體（9種新的靶分子）現(xiàn)在是57頁\一共有59頁\編輯于星期四靶分子抗體種類治療疾病商品名公司批準(zhǔn)時間CD分子

IL-6R人源化抗體（IgG1）阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合，治療RA,Castelman病RoActemra/TocilizumabChugai/Roche200