腫瘤微環(huán)境中腹腔巨噬細(xì)胞的流式檢測(cè)方法

腫瘤微環(huán)境中腹腔巨噬細(xì)胞的流式檢測(cè)方法步驟準(zhǔn)備：大小BD管，10ml空針，1ml空針，無菌生理鹽水或PBS，紅細(xì)胞裂解液（4度冰箱保存）。流式管若干。流式抗體：CD45，CD11b，F(xiàn)4/80，CD206，每種抗體均有4中不同的顏色（Percp-cy5.5,APC,FITC,PE),選抗體顏色時(shí)每種抗體顏色不能重復(fù)（需要提前一天或半天檢查抗體是否足夠，若不夠，需及時(shí)向管家補(bǔ)齊，此點(diǎn)很重要！）。各種型號(hào)的槍和槍尖。冰盒（有蓋的，可以避光）。離心機(jī)。收集腹腔細(xì)胞：15mlBD管收集腹水或腹腔灌洗液，離心（1500rpm，3min），棄上清。裂紅：若腹水中有紅細(xì)胞時(shí)則裂紅，若無，則省略此步驟。方法：紅細(xì)胞裂解液4ml-8ml，冰上裂解3-10min，離心，棄上清。PBS4ml洗一次。說明：根據(jù)紅細(xì)胞多少?zèng)Q定裂紅液的量和時(shí)間，但時(shí)間不能過長(zhǎng)。若一次沒有裂干凈，最好先離心，用PBS洗之后再裂第二次，裂紅液持續(xù)作用的時(shí)間不能過長(zhǎng)。PBS重懸：1ml重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)（按魏老師的說法是需要計(jì)數(shù)的）。將BD管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中，每個(gè)流式管的細(xì)胞約1x106個(gè)。一般情況，每只老鼠腹腔細(xì)胞是多于1x106個(gè)的，剩下的細(xì)胞可作為單染或空白管的細(xì)胞來源。孵抗體：巨噬細(xì)胞膜上直標(biāo)抗體選擇CD45，CD11b，F(xiàn)4/80，CD206，冰上避光孵育30min，之后的步驟均避光較好。說明：染色分為：樣品管，空白管，單染管。樣品管每種抗體加1ul，如9個(gè)樣品管，可先將每種抗體10ul，加入干凈的小ep管中混勻后，再每個(gè)樣品管加4ul?？瞻坠芎蛦稳竟艿募?xì)胞由每個(gè)樣品的剩余細(xì)胞混合而成?？瞻坠芗词裁炊疾蝗?。單染管只加一種抗體，如CD45單染管只加CD45抗體。PBS1ml洗一次。PBS重懸，novocyte上機(jī)：根據(jù)細(xì)胞量的多少，加入200-300ulPBS重懸。多則多加，少則少加。腹腔巨噬細(xì)胞流式結(jié)果分析NatureImmunology

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JelenaSBezbradica,etal.ArolefortheITAMsignalingmoduleinspecifyingcytokine-receptorfunctionsBlood

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Kurotaki,etal.EssentialroleoftheIRF8-KLF4transcriptionfactorcascadeinmurinemonocytedifferentiationF4/80CD11b圈門方法注意事項(xiàng)1/提取腹腔細(xì)胞至細(xì)胞染色時(shí)間不能太長(zhǎng)，因細(xì)胞放久了不好，另外巨噬細(xì)胞可能發(fā)生變化，比如說它可以吞噬紅細(xì)胞，向II型轉(zhuǎn)