第十二章動(dòng)物干細(xì)胞技術(shù)簡介

第一節(jié)干細(xì)胞簡介干細(xì)胞的定義自我更新和分化潛能的細(xì)胞,在細(xì)胞發(fā)育過程中處于較原始階段.干細(xì)胞的分類干細(xì)胞有兩方面區(qū)別于其它細(xì)胞的特征：

1，可分化為與自身完全相同的細(xì)胞，2，可生產(chǎn)出特異性分化的細(xì)胞。

根據(jù)個(gè)體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細(xì)胞可分為兩類：胚胎干細(xì)胞及成體干細(xì)胞。現(xiàn)在是1頁\一共有71頁\編輯于星期五1.帶間充質(zhì)干細(xì)胞：大量存在于臍帶組織中，具有胚胎干細(xì)胞類似的增殖能力和多向分化潛能，來源豐富、取材方便、無道德倫理爭議，可獲取的細(xì)胞數(shù)量多、活力強(qiáng)，療效顯著，可以擴(kuò)增和傳代，同時(shí)又沒有配型、排斥等問題，不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，也是最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：人體骨髓干細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，從自體骨髓提取間充質(zhì)干細(xì)胞，雖然技術(shù)門檻比較低，但需要抽取病人大量骨髓（往往難以做到），其干細(xì)胞數(shù)量也難以穩(wěn)定滿足臨床治療的要求。因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的局限?，F(xiàn)在是2頁\一共有71頁\編輯于星期五3.臍帶血干細(xì)胞：臍帶血除了包含正常血液的紅細(xì)胞、白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞外，還包含單個(gè)核細(xì)胞、造血干細(xì)胞。目前最具應(yīng)用價(jià)值的是利用臍血中的造血干細(xì)胞治療白血?。ü撬枰浦玻＠媚殠а膯蝹€(gè)核細(xì)胞和造血干細(xì)胞治療血液病以外的疾病，由于所含干細(xì)胞數(shù)量稀少（僅占臍血細(xì)胞的0.98%），雖然有一定的治療效果，但不能等同于真正意義上的間充質(zhì)干細(xì)胞治療，可作為間充質(zhì)干細(xì)胞治療的補(bǔ)充。4.胚胎干細(xì)胞：存在于早期胚胎，獲取胚胎干細(xì)胞來源比較困難，道德倫理風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，因此胚胎干細(xì)胞在臨床治療中使用頗受爭議,胚胎干細(xì)胞，又稱全能干細(xì)胞，存在于未發(fā)育成熟的胚胎，高水平表達(dá)端粒酶，可分化為除構(gòu)成臍胎盤，臍帶等之外的任何一種特定類型細(xì)胞。即能長成動(dòng)物的任何組織和器官?，F(xiàn)在是3頁\一共有71頁\編輯于星期五(1)全能性干細(xì)胞它具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞，具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和很強(qiáng)的分化能力，可以無限增殖并分化成為全身200多種細(xì)胞類型，進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織、器官。

(2)多能性干細(xì)胞這種干細(xì)胞具有分化出多種組織細(xì)胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。骨髓多能造血干細(xì)胞是典型的例子，它可分化出至少12種血細(xì)胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細(xì)胞。

(3)單能干細(xì)胞也稱專能或偏能干細(xì)胞。這類干細(xì)胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如上皮組織基底層的干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞或叫衛(wèi)星細(xì)胞?，F(xiàn)在是4頁\一共有71頁\編輯于星期五第二節(jié)胚胎干細(xì)胞的特性形態(tài)學(xué)特征ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少，結(jié)構(gòu)簡單。體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長。用堿性磷酸酶染色，ES細(xì)胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細(xì)胞呈淡黃色。細(xì)胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細(xì)胞彼此界限不清，細(xì)胞表面有折光較強(qiáng)的脂狀小滴。細(xì)胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。小鼠ES細(xì)胞的直徑7μm～18μm，豬、牛、羊ES細(xì)胞的顏色較深，直徑12μm～18μm?，F(xiàn)在是5頁\一共有71頁\編輯于星期五特異性標(biāo)志分子的表達(dá)ES細(xì)胞的全能性指ES細(xì)胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細(xì)胞具有發(fā)育成完整動(dòng)物體的能力，可以為細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞分化研究提供豐富的試驗(yàn)材料。ES細(xì)胞發(fā)育全能性的標(biāo)志是ES細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)相專一性胚胎抗原（Stagespecificembryonicant，SSEA），而且可以檢查到OTC4基因的表達(dá)，這兩種蛋白是發(fā)育全能性的標(biāo)志。ES細(xì)胞中AKP及端粒酶活性較高，可用于ES細(xì)胞分化與否的鑒定。ES細(xì)胞的多能性是指ES細(xì)胞具有發(fā)育成多種組織的能力，參與部分組織的形成。將ES細(xì)胞培養(yǎng)在不含分化抑制物的培養(yǎng)基上，可以形成類胚體。將ES細(xì)胞在特定培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可以定向分化成特定組織，如ES細(xì)胞在含有白血病抑制因子（LIF）和維生素A酸（RA）的培養(yǎng)基上，可以分化形成全壁內(nèi)胚層，將ES細(xì)胞與胚胎細(xì)胞共培養(yǎng)或?qū)S細(xì)胞注入囊胚腔中，ES細(xì)胞就會(huì)參與多種組織的發(fā)育?，F(xiàn)在是6頁\一共有71頁\編輯于星期五細(xì)胞周期的特征端粒酶一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，RNA組分中含有一段短的模板序列與端粒DNA的重復(fù)序列互補(bǔ)，而其蛋白質(zhì)組分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA的合成，將其加到端粒的3′端，以維持端粒長度及功能?，F(xiàn)在是7頁\一共有71頁\編輯于星期五第三節(jié)胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)分化抑制物的選擇和培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)早期胚胎的選擇及培養(yǎng)分離及培養(yǎng)過程ES細(xì)胞的鑒定ES細(xì)胞的冷凍保存ES細(xì)胞系的建立及保存現(xiàn)在是8頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是9頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是10頁\一共有71頁\編輯于星期五第四節(jié)胚胎干細(xì)胞的定向分化胚胎性干細(xì)胞定向分化的常用策略分化細(xì)胞的鑒定與純化現(xiàn)在是11頁\一共有71頁\編輯于星期五干細(xì)胞應(yīng)用細(xì)胞替代治療角膜病、糖尿病、帕金森病實(shí)例組織替代治療如皮膚、軟組織、骨骼等組織病變器官替代無排斥反應(yīng)的器官移植現(xiàn)在是12頁\一共有71頁\編輯于星期五干細(xì)胞培植眼角膜進(jìn)行眼角膜移植修補(bǔ)手術(shù)干細(xì)胞培植心肌細(xì)胞治療原發(fā)性心臟病現(xiàn)在是13頁\一共有71頁\編輯于星期五骨髓干細(xì)胞可以自行轉(zhuǎn)移到人腦，并可以轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ荦R全的腦細(xì)胞治療腦損傷、老年癡呆癥以及帕金森氏綜合癥

現(xiàn)在是14頁\一共有71頁\編輯于星期五骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞增殖分化現(xiàn)在是15頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是16頁\一共有71頁\編輯于星期五雙刃劍人類基因組計(jì)劃引發(fā)倫理、法律和社會(huì)問題克隆人與人獸雜交克隆造成倫理觀念的沖擊生物技術(shù)被別有居心者的使用現(xiàn)在是17頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是18頁\一共有71頁\編輯于星期五動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)

EmbryonicStemcells（EScells）一、概述二、胚胎干細(xì)胞研究的意義三、胚胎干細(xì)胞研究的歷史四、胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本程序五、胚胎干細(xì)胞技術(shù)目前存在的問題和發(fā)展遠(yuǎn)景現(xiàn)在是19頁\一共有71頁\編輯于星期五胚胎干細(xì)胞技術(shù)

EmbryonicStemcells(EScells)一、概述哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）一般是指從早期胚胎經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分離出來的具有全能性的細(xì)胞。ES細(xì)胞是由Evans和Kauf-man1981年首次從延遲小鼠囊胚中分離出來的多能性細(xì)胞，當(dāng)時(shí)稱之為EK細(xì)胞。以后稱之為胚胎干細(xì)胞?，F(xiàn)在是20頁\一共有71頁\編輯于星期五人胚胎干細(xì)胞分離技術(shù)途徑ICMPGCs現(xiàn)在是21頁\一共有71頁\編輯于星期五ES細(xì)胞的特點(diǎn)：ES細(xì)胞具有胚胎細(xì)胞的特性，在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小、核大，核仁突出，培養(yǎng)時(shí)呈克隆狀生長；在功能上，ES細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，即具有分化為成年動(dòng)物體內(nèi)任何一種細(xì)胞類型的能力。ES細(xì)胞具有細(xì)胞系的特征，在飼養(yǎng)層上能維持未分化狀態(tài)并實(shí)現(xiàn)自我更新。因?yàn)榭蔁o限增殖，也可冷凍保存。現(xiàn)在是22頁\一共有71頁\編輯于星期五二、胚胎干細(xì)胞研究的意義ES細(xì)胞在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價(jià)值的工具；ES細(xì)胞是研究細(xì)胞分化的理想手段；圖ES細(xì)胞是研究基因功能的首選細(xì)胞；Es細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要途徑之一；ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場醫(yī)學(xué)革命；ES細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選?，F(xiàn)在是23頁\一共有71頁\編輯于星期五二、胚胎干細(xì)胞研究的歷史1、1981年Evans和Kaufman獲得小鼠ES細(xì)胞系2、1988年Doetschman獲得倉鼠ES細(xì)胞系3、1994年Wheeler和Robert獲得豬ES細(xì)胞系4、1998年Thomson獲得人的ES細(xì)胞系5、2007年日本的Yamanaka研究小組和美國的JamesThomson研究小組分別獲得誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcell，iPS細(xì)胞）現(xiàn)在是24頁\一共有71頁\編輯于星期五四、胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本程序(一)選擇抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系1、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系2、條件培養(yǎng)體系3、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系現(xiàn)在是25頁\一共有71頁\編輯于星期五四、胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本程序（二）早期胚胎的選擇（三）胚胎干細(xì)胞的分離（四）胚胎干細(xì)胞的保持（五）胚胎干細(xì)胞的鑒定（六）胚胎干細(xì)胞的分化潛力驗(yàn)證現(xiàn)在是26頁\一共有71頁\編輯于星期五五、胚胎干細(xì)胞技術(shù)目前存在的問題和發(fā)展遠(yuǎn)景1、根據(jù)細(xì)胞的分化特點(diǎn)建立更有效的培養(yǎng)體系2、加強(qiáng)胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化研究3、提高家畜胚胎干細(xì)胞的分離水平4、加速胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用現(xiàn)在是27頁\一共有71頁\編輯于星期五第七節(jié)嵌合體Chimera

嵌合體動(dòng)物：指由2個(gè)以上不同的受精卵或3個(gè)以上的配子相結(jié)合，有不同基因型的細(xì)胞群所構(gòu)成的復(fù)合體。嵌合體動(dòng)物制作方法：1、集合（凝集）法：在卵裂階段使2個(gè)以上的胚胎發(fā)生粘著和結(jié)合。2、注入法：在臨近著床的胚泡期，用顯微操作方法將另一個(gè)體的細(xì)胞注入到囊胚腔中。

現(xiàn)在是28頁\一共有71頁\編輯于星期五研究現(xiàn)狀：

家畜的嵌合體不但已在個(gè)體間和品種間取得成功（綿羊、牛等），而且在異種間也得到了活的后代，如綿山羊人工嵌合體，該技術(shù)對遺傳學(xué)研究具有重要意義，塑造特異性狀的新奇物種，從而為動(dòng)物園展示了新的前景，嵌合體也被用來研究免疫學(xué)系統(tǒng)的機(jī)理?，F(xiàn)在是29頁\一共有71頁\編輯于星期五哺乳動(dòng)物嵌合體生產(chǎn)基本方法示意圖12現(xiàn)在是30頁\一共有71頁\編輯于星期五小鼠胚胎囊胚腔注入嵌合法現(xiàn)在是31頁\一共有71頁\編輯于星期五嵌合體豬Femalepiglet6899developedfromaDuroc-Pietrainblastocyst(redandblackpigmentation)injectedwithGermanLand-racePGCs(whitepigmentationonheadandlegs).

(B)Chimericpiglets7003(male)and7006(female)withredareasacrossthebackdevelopedfrom‘‘red’’DuroccellsinjectedintoLandraceblastocysts.現(xiàn)在是32頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是33頁\一共有71頁\編輯于星期五誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞的研究里程碑式的科學(xué)突破現(xiàn)在是34頁\一共有71頁\編輯于星期五細(xì)胞重編程的研究概況現(xiàn)在是35頁\一共有71頁\編輯于星期五核移植核移植試驗(yàn)最初是在兩棲動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)的，通過將體細(xì)胞核注入到去核卵母細(xì)胞中。迄今，人們已經(jīng)獲得了多種核移植動(dòng)物，也建立了來源于核移植胚胎的胚胎干細(xì)胞系?，F(xiàn)在是36頁\一共有71頁\編輯于星期五體細(xì)胞核移植試驗(yàn)也具有很大的局限性克隆的效率極低產(chǎn)生的許多后代在各個(gè)階段都體現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育異常由于需要卵母細(xì)胞，核移植實(shí)驗(yàn)在人類中的應(yīng)用受到強(qiáng)烈的倫理學(xué)質(zhì)疑這些不足，都制約了核移植技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用?，F(xiàn)在是37頁\一共有71頁\編輯于星期五

將成熟的體細(xì)胞與多潛能的細(xì)胞（ES細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞等）融合，或者用胚胎干細(xì)胞提取物來處理體細(xì)胞，也可以在一定程度上使體細(xì)胞發(fā)生重編程。利用這兩種方法，可以實(shí)現(xiàn)某些多功能性標(biāo)志分子的重新表達(dá)和多種分化潛能的獲得。但是，體細(xì)胞與多能性細(xì)胞的融合率較低，融合之后的細(xì)胞具有兩套染色體，并且在移植后會(huì)發(fā)生排斥現(xiàn)象，這就制約了細(xì)胞融合的臨床應(yīng)用?，F(xiàn)在是38頁\一共有71頁\編輯于星期五有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？現(xiàn)在是39頁\一共有71頁\編輯于星期五里程碑式的科學(xué)突破2006年11月20日，日本京都大學(xué)的山中伸彌（ShinyaYamanaka)和美國威斯康星大學(xué)的詹姆斯·湯姆森（JamesThomson）分別在《細(xì)胞》和《科學(xué)》雜志上發(fā)表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細(xì)胞改造成了類胚胎干細(xì)胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細(xì)胞相媲美?，F(xiàn)在是40頁\一共有71頁\編輯于星期五詹姆斯·湯姆森小組的論文發(fā)表在11月20日的《科學(xué)》雜志上現(xiàn)在是41頁\一共有71頁\編輯于星期五俞君英是11月20日《科學(xué)》雜志論文的第一作者現(xiàn)在是42頁\一共有71頁\編輯于星期五2006年8月，日本科學(xué)家山中伸彌小組首先在小鼠身上取得成功現(xiàn)在是43頁\一共有71頁\編輯于星期五誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞2006年，Takahashi和Yamnaka將幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，進(jìn)而獲得了類似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，稱之為“誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞”（inducedpluripotentstemcells,iPS細(xì)胞）。這一研究明確地證實(shí)了分化的細(xì)胞可以通過少數(shù)幾個(gè)因子的外源導(dǎo)入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)，因而受到了整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。現(xiàn)在是44頁\一共有71頁\編輯于星期五在研究誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞產(chǎn)生的原理機(jī)制之前，先了解一下體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞的研究進(jìn)展體細(xì)胞重編程的過程體細(xì)胞重編程的原理體細(xì)胞不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞的方法現(xiàn)在是45頁\一共有71頁\編輯于星期五成體細(xì)胞核的重編程1.核重編程：核移植后供體核停止本身的基因表達(dá)程序，恢復(fù)為胚胎發(fā)育所必需的胚胎化基因表達(dá)程序狀態(tài)。此過程包括：染色體結(jié)構(gòu)重建、DNA甲基化、組蛋白乙?；⒂∮浕虮磉_(dá)、端粒長度恢復(fù)、X染色體失活等。現(xiàn)在是46頁\一共有71頁\編輯于星期五甲基化

1.2.合子型基因的重新激活，如：Oct-42.重塑核結(jié)構(gòu)主要有包括核纖層A、B、C三種核纖層蛋白的重塑現(xiàn)在是47頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是48頁\一共有71頁\編輯于星期五3.細(xì)胞質(zhì)重編程—miRNAmiRNA是決定細(xì)胞分化方向的因子。細(xì)胞中miRNA成分的改變能提高細(xì)胞對調(diào)節(jié)基因表達(dá)重編程?，F(xiàn)在是49頁\一共有71頁\編輯于星期五接下來，介紹一下體細(xì)胞重編程不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞的方法之一：通過特定基因的表達(dá)將體細(xì)胞重編程過程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞?！盎蛑匦戮幣偶夹g(shù)”，借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細(xì)胞中植入一組4個(gè)基因(Oct4,Sox2,c-myc和Klf4)，通過基因重新編排，使皮膚細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞的功能。這種被改造過的細(xì)胞稱作“iPS細(xì)胞”。現(xiàn)在是50頁\一共有71頁\編輯于星期五下面簡單介紹一下這些研究中所用到的多能性相關(guān)因子Oct4,Sox2,c-myc和Klf4在多能性調(diào)控中的作用?，F(xiàn)在是51頁\一共有71頁\編輯于星期五1.Oct3/4Oct-4（也稱Oct-3）屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員[1~3]。是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。是全能性的標(biāo)志，它能夠促使ICM形成、維持胚胎干細(xì)胞未分化前狀態(tài)并促進(jìn)其增殖?，F(xiàn)在是52頁\一共有71頁\編輯于星期五2.SOX2基因SOX2基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的主控基因（mastergenes）家族的一個(gè)成員。轉(zhuǎn)錄因子是些與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的蛋白質(zhì)現(xiàn)在是53頁\一共有71頁\編輯于星期五3.癌癥基因c-MYC癌癥基因c-MYC，是一種最容易過渡表現(xiàn)于人類的致癌基因，它對某些成體干細(xì)胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細(xì)胞的分化?，F(xiàn)在是54頁\一共有71頁\編輯于星期五4.Klf4Krueppel-likefactor4，KLF4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子Klf4(舊稱GKLF)調(diào)節(jié)體外細(xì)胞的增生與分化現(xiàn)在是55頁\一共有71頁\編輯于星期五iPS細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)制已分化的細(xì)胞導(dǎo)入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4病毒逆轉(zhuǎn)錄胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件和篩選Ips細(xì)胞現(xiàn)在是56頁\一共有71頁\編輯于星期五誘導(dǎo)多功能細(xì)胞現(xiàn)在是57頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是58頁\一共有71頁\編輯于星期五我們已經(jīng)了解了體細(xì)胞重編程的原理和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制，下面讓我們再深入了解一下Ips細(xì)胞的研究概況和Ips細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)在是59頁\一共有71頁\編輯于星期五Ips細(xì)胞的研究概況（研究方法）這是一種具有很強(qiáng)創(chuàng)新性的研究方法：通過外源導(dǎo)入與多功能相關(guān)并且能使重組細(xì)胞恢復(fù)全能性的轉(zhuǎn)錄基因來誘導(dǎo)體細(xì)胞核發(fā)生重新編程，從而使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成多能性干細(xì)胞。這種方法所受的啟示來源于“ES細(xì)胞-體細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)”。細(xì)胞的多能性收到許多因子精密而又復(fù)雜的調(diào)控。ES細(xì)胞和體細(xì)胞融合后能誘導(dǎo)體細(xì)胞核的重新編程，ES細(xì)胞中存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關(guān)重要?，F(xiàn)在是60頁\一共有71頁\編輯于星期五現(xiàn)在是61頁\一共有71頁\編輯于星期五Ips細(xì)胞的研究概況（兩個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)）Ips細(xì)胞首先由科學(xué)家Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。實(shí)驗(yàn)原理如下：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入了4個(gè)與多功能性有關(guān)的基因：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4。利用多能性標(biāo)志分子Fbx15的表達(dá)對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行了篩選，最終的到了ips細(xì)胞，這種細(xì)胞的功能和性能幾乎和胚胎干細(xì)胞一樣。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的對象是人類皮膚成纖維細(xì)胞的重編程，而實(shí)驗(yàn)的過程和上一個(gè)實(shí)驗(yàn)基本相同；。只是對所篩選的轉(zhuǎn)錄基因做了一下修飾：去掉了腫瘤相關(guān)因子c-Myc，使ips細(xì)胞的生產(chǎn)更加安全現(xiàn)在是62頁\一共有71頁\編輯于星期五Ips細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)

（幾種因子的發(fā)現(xiàn)過程）日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞中那個(gè)存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關(guān)重要?？茖W(xué)家對24個(gè)與多能性維持相關(guān)的候選基因?qū)胄∈蟪衫w維細(xì)胞中，依次去掉其中一個(gè)基因，最后在得到的10個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)至關(guān)重要的基因，其中任何一個(gè)缺失都將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗，這4個(gè)基因中的任意2個(gè)或3個(gè)組合都無法形成具有ES細(xì)胞特性的ips細(xì)胞。從而確定了：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4這4種基因現(xiàn)在是63頁\一共有71頁\編輯于星期五人類ES細(xì)胞能夠通過細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)室體細(xì)胞發(fā)生重編程。美國科學(xué)家比較了人類ES細(xì)胞和髓前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜，挑選出許多在ES細(xì)胞和髓前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜，挑選出許多在ES細(xì)胞中相對高表達(dá)的基因。再根據(jù)這些基因在多能性調(diào)控中的已知功能對其進(jìn)行了排序，從中選出14個(gè)候選基因。將這些基因以不同的組合方式導(dǎo)入一種由人類ES細(xì)胞分化得到的間充質(zhì)樣細(xì)胞后，檢驗(yàn)了不同基因的導(dǎo)入對這種細(xì)胞重編程的作用。最后鎖定了4種因子：Oct4,Sox2,Nanog,Lin28.現(xiàn)在是64頁\一共有71頁\編輯于星期五Ips細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)

（Ips細(xì)胞的篩選）

Ips細(xì)胞的篩選：主要有三種方法：形態(tài)學(xué)篩選、藥物篩選和選用對多能性更為關(guān)鍵的基因作為報(bào)告基因。其中利用Fbx15對ips細(xì)胞進(jìn)行篩選，原理是Fbx25對于多能性的維持和胚胎的發(fā)育來說是不可缺少的基因，所以Fbx25作為篩選ips細(xì)胞的報(bào)告基因。僅利用形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)來代替報(bào)告基因的篩選。Maherali等人發(fā)現(xiàn)，僅僅依靠形態(tài)學(xué)篩選可能就足以建立ips細(xì)胞系。后來的研究證實(shí)了在不對供體細(xì)胞做任何額外遺傳修飾的情況下，僅依靠形態(tài)學(xué)篩選的標(biāo)準(zhǔn)對細(xì)胞進(jìn)行篩選也能夠分離出小鼠的ips細(xì)胞。 利用基因重組技術(shù)建立了具有藥物抗性基因的體細(xì)胞，這些細(xì)胞的抗性受內(nèi)源性Nanog或O