單克隆抗體的制備實驗課件

單克隆抗體制備實驗CasparGu2011-4-12目錄實驗目的實驗原理實驗材料實驗步驟注意事項一、實驗目的了解并掌握單克隆抗體的制備原理；

熟悉單克隆抗體的制備過程；熟練掌握無菌操作技術。三、實驗材料1儀器設備2手術器具超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。

剪刀、鑷子、解剖板、平皿（直徑為10cm），15ml/50ml一次性離心管，50ml玻璃融合管200目不銹鋼細胞篩，玻璃注射器針芯，10ml玻璃注射器（9號針頭）

4試驗動物

ICR小鼠1只，BALB/c小鼠1只

3實驗試劑PEG1500，無血無抗RPMI1640培養(yǎng)基，HT/HAT培養(yǎng)基（含10%FBS/CBS，工作濃度HT/HAT的RPMI1640培養(yǎng)基）

5Sp2/0細胞融合前一周復蘇，第二天換液，長滿后傳代，融合前一天換液。一次融合需2~3瓶（75m2）Sp2/0細胞。四、實驗步驟(1)1.取飼養(yǎng)細胞取一只SPF級6-8周齡ICR小鼠，斷頸處死，置75%乙醇中消毒5min↓取一只10ml玻璃注射器，吸入7~8ml含10%FBS、HAT的RPMI1640培養(yǎng)基，剪開皮膚、沿切口上下撕開皮膚，充分暴露腹部，換鑷子，拎起腹膜，沿腹部中線偏左下方進針，針頭不要進入內(nèi)臟器官，取一個干凈的酒精棉球輕輕擠壓小鼠腹部，同時反復吹打注射器，反復3-5次，待培養(yǎng)基變黃后將其轉(zhuǎn)移到80mlHAT培養(yǎng)基中，備用。

2.取免疫小鼠脾臟免疫小鼠摘眼球取血后斷頸處死，置75%乙醇中消毒5min↓將高壓過的細胞曬放到平皿中，細胞曬中加入10ml左右的無血清1640，小鼠左側(cè)臥位，剪開皮膚，沿切口上下撕開皮膚，可以看到脾臟所在位置；換剪刀、鑷子，剪開腹膜，充分暴露脾臟；換剪刀、鑷子，鑷子輕輕夾住脾臟，用剪刀分離脾臟，盡量不要帶結(jié)締組織，將脾臟放入鋼網(wǎng)中，用無菌的針頭戳幾下，用玻璃針芯輕輕擠壓脾臟直至僅剩包膜，用幾毫升無血清1640沖洗針芯和細胞曬，將濾液置于50ml離心管中，備用。3.收集Sp2/0細胞

取已長滿的Sp2/0細胞2~3瓶，用彎頭尖吸管將細胞吹下來，置于50ml離心管中，原瓶補液繼續(xù)培養(yǎng)↓4.清洗脾細胞和Sp2/0細胞

800rpm，離心5min↓棄上清，輕輕磕幾下50ml離心管底部（使細胞團塊松散），加入兩吸管無血清1640，輕輕吹打均勻，補培養(yǎng)液至20ml↓脾細胞和Sp2/0細胞，800rpm，離心5min↓5.融合

將PEG1500置于37℃水浴鍋上，熔化后，加入0.5ml無血清1640，混勻，即為50%PEG↓取離心好的脾細胞和Sp2/0細胞，棄上清（注意保持這個姿勢）用濾紙條輕輕沾去管壁上的培養(yǎng)液（保證PEG不被稀釋）。將離心管放到37℃水浴中（用一小燒杯制備水?。?min加入PEG（邊加邊攪），攪30sec；靜止1min。四、實驗步驟(2)五.注意事項1.無菌操作：單克隆抗體的制備過程需要嚴格無菌，包括使用的器械、試劑等均需要無菌處理，注意實驗操作中的無菌操作;2.用于免疫的動物，應選擇與親本骨髓瘤細胞同一品系的動物