園藝植物組織培養(yǎng)

園藝植物組織培養(yǎng)第1頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

一、植物組織培養(yǎng)的概念

1.概念

植物組織培養(yǎng)（Planttissueculture）廣義上是指無(wú)菌條件下，在特定的培養(yǎng)基上對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體甚至包括完整植株進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。第2頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

2.主要特征（1）在培養(yǎng)容器中進(jìn)行；（2）無(wú)菌培養(yǎng)環(huán)境，排除了微生物如真菌、細(xì)菌以及害蟲等的侵入；（3）各種環(huán)境因子如營(yíng)養(yǎng)因子、激素因子以及光照、溫度等物理因子處于人工控制之下，并可達(dá)到最適條件。（4）通常打破了正常的植物發(fā)育過(guò)程和格局；（5）隨著單細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)植物顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行操作成為可能。第3頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷史

1、早期探索階段（1930年以前）

1893年，Schwann和Scheiden提出細(xì)胞學(xué)說(shuō)及植物細(xì)胞全能性理論。

1902年，德國(guó)植物生理學(xué)家Haberlandt第一次嘗試采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)小野芝麻、風(fēng)眼蘭葉肉組織及萬(wàn)年青屬植物的表皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，但未能培養(yǎng)成活。

1904年，Hanning首次對(duì)十字花科的蘿卜和辣根的胚培養(yǎng)成功。

1922年，Knudson將蘭花種子在離體的條件下非共生萌發(fā)。同年，Knotte和Robbins對(duì)離體根尖進(jìn)行了培養(yǎng)。Robbins還對(duì)豌豆、玉米及棉花的莖尖進(jìn)行了培養(yǎng)，只形成一些缺綠的葉和根。

1925年，Laibach利用胚培養(yǎng)技術(shù)對(duì)亞麻的種間雜種胚進(jìn)行了培養(yǎng)，并于1929年利用亞麻的胚培養(yǎng)來(lái)克服雜交不親和性。第4頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的初步形成（1930-1960年）

1933年，我國(guó)植物生理學(xué)家李繼侗培養(yǎng)銀杏胚胎，并發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳提取液可促進(jìn)離體胚的生長(zhǎng)。

1937年，White發(fā)現(xiàn)B族維生素對(duì)離體根培養(yǎng)的重要性。并指出IAA對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的控制起重要作用。

1937,1938年，Gantheret在培養(yǎng)基中加入上述生長(zhǎng)因子，使得柳樹形成層誘導(dǎo)形成的愈傷組織連續(xù)生長(zhǎng)。Nobecomt對(duì)煙草種間雜種莖段的形成層細(xì)胞培養(yǎng)也得到了類似的結(jié)果。

1948年，Skoog等通過(guò)對(duì)煙草莖段和髓培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不定芽和不定根的發(fā)生由生長(zhǎng)素/腺嘌呤的比例決定。

1950年，Ball從紅杉愈傷組織培養(yǎng)中再生獲得器官。第5頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1952年，Morel和Martin通過(guò)分生組織培養(yǎng)獲得大麗花的脫毒植株，同年，首次應(yīng)用微型嫁接技術(shù)。1953年，Tuleche首次從花粉培養(yǎng)中獲得銀杏的單倍體愈傷組織。1955年，Miller等發(fā)現(xiàn)了一種促進(jìn)細(xì)胞分裂的植物激素—激動(dòng)素，后來(lái)發(fā)現(xiàn)激動(dòng)素可用來(lái)代替腺嘌呤促進(jìn)芽的形成，而且其效力比后者高3萬(wàn)倍。1957年，Skoog和Miller發(fā)現(xiàn)改變細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素比例，可以控制根和芽的發(fā)生。1958年，Maheshwari和Rangaswamy從柑橘胚珠的珠心組織培養(yǎng)中再生獲得體細(xì)胞胚；同年，Reinert和Steward分別從胡蘿卜的愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中再生得到原胚，為以后的組織培養(yǎng)中器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，也為植物細(xì)胞全能性理論提供了證據(jù)。第6頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展（1960年以后）1960年，Morel利用蘭花莖尖培養(yǎng)對(duì)蘭花進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖；1962年，Murashige和Skoog開發(fā)出最著名的Murashige和Skoog培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基），并被后來(lái)廣泛采用的基本培養(yǎng)基。1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀羅花粉培養(yǎng)獲得第一例單倍體植株。從而開辟了單倍體育種技術(shù)。1971年，Takebe等獲得第一例原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。1972年，Carlson等利用原生質(zhì)體融合在兩個(gè)煙草屬中進(jìn)行種間雜交。1974年，Murashige等利用細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)莖尖側(cè)芽分枝。Zaenen和Larebeke分別發(fā)現(xiàn)土壤農(nóng)桿菌（Agribacterium）中的根瘤誘導(dǎo)的主要成分是Ti質(zhì)粒。1978年，Melchers等進(jìn)行了番茄和馬鈴薯的體細(xì)胞雜交。第7頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1979年，Marton提出了利用植物原生質(zhì)體和土壤農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。1981年，Larkin和Scowcroft引入“體細(xì)胞無(wú)性系變異（Somaclonalvariation）”這一術(shù)語(yǔ)。1982年，Krens等的工作證明，原生質(zhì)體可以攝入裸露的DNA，表明可以用外源DNA對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。1982年，Zimmermann利用電刺激進(jìn)行原生質(zhì)體融合。1985年，Horsch等用土壤農(nóng)桿菌對(duì)葉盤進(jìn)行感染和轉(zhuǎn)化，并得到再生的轉(zhuǎn)化植株。第8頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

二、植物組織培養(yǎng)類型（根據(jù)不同分類的依據(jù)可以分為不同類型）

1、根據(jù)培養(yǎng)材料不同分為：

（1）完整植株培養(yǎng)（PlantCulture）：對(duì)幼苗和較大植株等的培養(yǎng)。（2）胚胎培養(yǎng)（EmbryoCulture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培養(yǎng)。（3）器官培養(yǎng)（OrganCulture）：包括離體根、莖、葉、果實(shí)、種子、花器官的培養(yǎng)。（4）組織培養(yǎng)（TissueCulture）：如分生組織、薄壁組織、輸導(dǎo)組織培養(yǎng)。（5）細(xì)胞培養(yǎng)（CellCulture）：指對(duì)單細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)。（6）原生質(zhì)體培養(yǎng)（ProtoplastCulture）：指對(duì)去掉細(xì)胞壁后所獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)。

第9頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四矮牽牛莖尖離體培養(yǎng)培養(yǎng)第10頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony第11頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四微型月季莖段離體培養(yǎng)第12頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四花燭葉片離體快速繁殖第13頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四大蒜根尖培養(yǎng)及植株再生第14頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四大蒜試管鱗莖誘導(dǎo)第15頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)第16頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四非洲紫羅蘭原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)及植株再生第17頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2、根據(jù)再生途徑分為：（1）器官發(fā)生途徑（Organogenesis）：直接器官發(fā)生途徑：植物器官可以直接由外植體上誘導(dǎo)。如莖尖培養(yǎng)。間接器官發(fā)生途徑：成熟細(xì)胞經(jīng)過(guò)脫分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）過(guò)程而形成新的組織和器官的過(guò)程。如葉片培養(yǎng)。（2）體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Somaticembryogenesis）：體胚發(fā)生途徑是指二倍體或單倍體的體細(xì)胞在特定條件下．未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過(guò)與合子胚發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程。經(jīng)體胚發(fā)生形成類似合子胚的結(jié)構(gòu)稱為胚狀體（embryoid）或體細(xì)胞胚(somaticembryo).

第18頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四直接器官發(fā)生間接器官發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生第19頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四貫葉金絲桃不定芽直接再生過(guò)程第20頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

優(yōu)化培養(yǎng)基無(wú)蔗糖1%蔗糖5%蔗糖

無(wú)BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l無(wú)NAA非洲紫羅蘭葉片培養(yǎng)骨特異性堿性磷酸酶BAP第21頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

優(yōu)化培養(yǎng)基無(wú)蔗糖1%蔗糖5%蔗糖

無(wú)BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l無(wú)NAA第22頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四臺(tái)灣百合離體培養(yǎng)第23頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四大花蕙蘭原球莖增殖與植株再生

器官發(fā)生途徑（原球莖的形成）：第24頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

大蒜愈傷組織培養(yǎng)第25頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

日本牽?；ǖ碾x體培養(yǎng)第26頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第27頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四禾本科牧草的體胚發(fā)生過(guò)程第28頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四菊花體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生第29頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四大蒜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程第30頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第31頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第32頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

人工種子（Artificialseed，SyntheticSeed）：是指植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體或不定芽被包裹在含有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中，從而形成能發(fā)芽出苗的顆粒體。作為繁殖材料。第33頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第34頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3、根據(jù)培養(yǎng)基的類型分為:

（1）固體培養(yǎng)（Solidculture）:瓊脂、卡拉膠等固化。（2）半液半固體培養(yǎng)(SemisolidCulture)：固液雙層。（3）液體培養(yǎng)(LiquidCulture)：震蕩、旋轉(zhuǎn)或靜置培養(yǎng)。第35頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

A不使用凝固劑，節(jié)約生產(chǎn)成本

B營(yíng)養(yǎng)吸收充分；

C操作過(guò)程簡(jiǎn)化。第36頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要,因而適用范圍比較廣。大量元素

成分分子量

使用濃度(mg/L)硝酸鉀

KNO3101.211900

硝酸銨

NH4NO380.041650磷酸二氫鉀

KH2PO4136.09170硫酸鎂

MgSO4.7H2O246.47370氯化鈣

CaCl2.2H2O147.02440

微量元素

碘化鉀

KI166.010.83

硼酸

H3BO361.836.2硫酸錳

MnSO4.4H2O223.0122.3硫酸鋅

ZnSO4.7H2O287.548.6鉬酸鈉

Na2MoO4.2H2O241.950.25硫酸銅

CuSO4.5H2O249.680.025氯化鈷

CoCl2.62237.930.025

鐵鹽

乙二胺四乙酸二鈉

Na2.EDTA372.2537.3

硫酸亞鐵

FeSO24.7H2O278.0327.8

有機(jī)成分

肌醇

100

甘氨酸

2鹽酸硫胺素VB1

0.1鹽酸吡哆醇VB6

0.5煙酸VB5或VPP

0.5

蔗糖

sucrose342.3130g/L

瓊脂

agar

7g/L第37頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)第38頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四體胚液體培養(yǎng)第39頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

不同類型液體培養(yǎng)裝置第40頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

液體培養(yǎng)體系第41頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四菠蘿種苗液體培養(yǎng)系統(tǒng)第42頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

丹參毛狀根培養(yǎng)第43頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞的全能性(Plantcellulartotipotency）從理論上講，植物體的每個(gè)生活細(xì)胞都具有該植物體的全部遺傳信息，在特定的離體培養(yǎng)條件下，具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。

第44頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第45頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

分化、脫分化與再分化：分化是指?jìng)€(gè)體發(fā)育過(guò)程中，不同部位的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生改變，形成不同組織或器官。脫分化也稱去分化，是指離體條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞、組織或器官逐漸失去原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生能力，形成無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織的過(guò)程。再分化是由脫分化形成的愈傷組織重新分化出特定細(xì)胞、組織和器官的過(guò)程。

細(xì)胞全能性的表達(dá)：盡管理論上每個(gè)細(xì)胞都具有全能性，但實(shí)際表達(dá)難易程度卻隨植物種類、組織和細(xì)胞的不同而異。第46頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四五、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1、優(yōu)質(zhì)種苗的快速無(wú)性繁殖：（1）無(wú)性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖園藝植物種苗工廠化生產(chǎn)第47頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四蘭科植物生產(chǎn)第48頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ABECFG花燭屬植物第49頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四厥類植物第50頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四盆栽及切花植物的繁殖第51頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四珍貴樹種第52頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四無(wú)菌苗快速繁殖第53頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四無(wú)菌苗馴化第54頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四組培苗馴化移栽第55頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第56頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第57頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

（2）通過(guò)莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒健康種苗：如草莓、香蕉、甘蔗、馬鈴薯、大蒜等。第58頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四virus-freetissue莖尖培養(yǎng)脫毒第59頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四脫毒馬鈴薯種薯生物反應(yīng)器液體培養(yǎng)第60頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2、用于植物遺傳育種包括種質(zhì)資源離體保存；花粉花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體；胚乳培養(yǎng)產(chǎn)生三倍體；胚培養(yǎng)拯救雜種胚克服遠(yuǎn)緣雜交障礙；原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行體細(xì)胞雜交；植物體細(xì)胞無(wú)性系變異誘導(dǎo)和篩選；用于植物基因轉(zhuǎn)移操作等。第61頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

種質(zhì)資源的離體保存第62頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四體細(xì)胞無(wú)性系變異篩選第63頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

花粉、花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株第64頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

幼胚拯救克服遠(yuǎn)緣雜交障礙第65頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

用于基因工程技術(shù)創(chuàng)造植物新種質(zhì)。第66頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3、大規(guī)模植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)；第67頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

根培養(yǎng):正常根培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)第68頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4、用于植物生長(zhǎng)發(fā)育理論研究，包括生理學(xué)、病理學(xué)、胚胎學(xué)和細(xì)胞與分子生物學(xué)等。第69頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

植物胚胎發(fā)生理論研究第70頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

生長(zhǎng)發(fā)育特性研究第71頁(yè)，共75頁(yè)，2023年，2月20日，星期四繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化

玻璃