細(xì)胞治療移植復(fù)發(fā)(二)

異基因造血干細(xì)胞移植（Allo-HSCT）是目前治愈急性白血病的主要方法。移植后復(fù)發(fā)是影響患者存活的主要障礙之一。移植后復(fù)發(fā)的治療手段主要有二次移植和DLI（供者淋巴細(xì)胞輸注）、停用免疫抑制劑和應(yīng)用細(xì)胞因子等方式。

前言第一頁(yè)，共41頁(yè)。

二次移植風(fēng)險(xiǎn)高，25%-50%的患者死于感染、急性GVHD等治療相關(guān)并發(fā)癥，且二次移植后復(fù)發(fā)率亦高達(dá)40-60%，兩年無(wú)病存活僅12%-21%。

DLI后GVHD總發(fā)生率為60%，其中40%Ⅱ、Ⅲ度aGVHD，20%左右Ⅲ、ⅣcGVHD。

迫切需要找到一種新的方法來(lái)改善其生存第二頁(yè)，共41頁(yè)。

免疫治療的發(fā)展，使其逐漸成為白血病患者造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)的治療手段之一。我們中心應(yīng)用細(xì)胞免疫治療急性非淋巴細(xì)胞白血病自體骨髓移植患者的結(jié)果表明5年生存率為75%,非細(xì)胞治療組5年生存率為45%，細(xì)胞組在累計(jì)生存率上明顯優(yōu)于非細(xì)胞治療組。第三頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞免疫治療大致分為兩類：一是疫苗治療，即輸注可在體內(nèi)刺激抗白血病活性的細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞（DC）相關(guān)腫瘤疫苗等；二是過繼性細(xì)胞免疫治療，即輸注有內(nèi)在抗白血病活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞，如細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷（CIK）細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）等。第四頁(yè)，共41頁(yè)。DC：樹突狀細(xì)胞，抗原提呈細(xì)胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵“決策細(xì)胞”增強(qiáng)針對(duì)腫瘤抗原免疫反應(yīng)的理想靶點(diǎn)目前全球已有3支DC腫瘤疫苗獲標(biāo)準(zhǔn)第五頁(yè)，共41頁(yè)。DC已由實(shí)驗(yàn)室走向臨床DC臨床反應(yīng)仍有限：成熟度，臨床反應(yīng)，外源性負(fù)載的表位數(shù)較少等?；蛐揎桪C：表達(dá)腫瘤抗原，增強(qiáng)免疫反應(yīng)的刺激因子、細(xì)胞因子，下調(diào)免疫負(fù)調(diào)控分子。-----未來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要方向第六頁(yè)，共41頁(yè)?；蛐揎桪C的優(yōu)勢(shì)

無(wú)MHC限制性提供更多的抗原表位保證持久的抗原表達(dá)胞內(nèi)抗原加工的抗原提呈更有效表達(dá)外源基因的病毒載體能刺激和激活DC

避免正?？乖?fù)載可能存在的自身免疫反應(yīng)ShurinMR,etal.NewYork:Springer.2009.第七頁(yè)，共41頁(yè)。T細(xì)胞激活（3種信號(hào)）第八頁(yè)，共41頁(yè)?；蛐揎桪C策略

導(dǎo)入編碼腫瘤抗原基因或表達(dá)抗原的mRNA

導(dǎo)入編碼免疫刺激分子、細(xì)胞因子、趨化因子、抗凋亡分子和其他增強(qiáng)DC功能因子的基因KikuchiT.TohokuJExpMed.2006.第九頁(yè)，共41頁(yè)。修飾方法與靶分子選擇ShurinMR,etal.ExpertOpinBiolTher.2010.第十頁(yè)，共41頁(yè)。第十一頁(yè)，共41頁(yè)。BoudreauJE,etal.MolTher.2011.第十二頁(yè)，共41頁(yè)?；蛐揎桪C臨床結(jié)果第十三頁(yè)，共41頁(yè)。Sipuleucel-T（美國(guó)，Dendreon）Sipuleucel-T利用DC負(fù)載PAP和GM-CSF的融合蛋白，這提示DC疫苗聯(lián)合細(xì)胞因子可能改進(jìn)治療結(jié)果。第十四頁(yè)，共41頁(yè)。AGS-003（美國(guó)，ArgosTherapeutics）

轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌自體腫瘤來(lái)源mRNA+合成的CD40LRNA第十五頁(yè)，共41頁(yè)。3期試驗(yàn)方案第十六頁(yè)，共41頁(yè)。病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)KikuchiT.TohokuJExpMed.2006.第十七頁(yè)，共41頁(yè)。載體對(duì)DC生物學(xué)影響RibasA.CurrGeneTher.2005.第十八頁(yè)，共41頁(yè)。

最近研究發(fā)現(xiàn)，APA分子（antigenpresentationattenuators）為抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)控制信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵性抑制因子，阻止了有效的抗自身腫瘤抗原的免疫反應(yīng)。

SOCS1（suppressorofcytokinesignaling1）是APA中最關(guān)鍵性抑制因子之一。因此我們?cè)诔Ｒ?guī)采用細(xì)胞因子促進(jìn)DC細(xì)胞成熟的基礎(chǔ)上，加上了針對(duì)APA的小干擾RNA以特異性阻斷其基因功能；加上特異性的腫瘤相關(guān)抗原（Survivin和muc1）負(fù)載，誘導(dǎo)的DC細(xì)胞與T細(xì)胞具有成熟度更高、功能與特異性更強(qiáng)的顯著優(yōu)點(diǎn)。第十九頁(yè)，共41頁(yè)。提高DC抗原呈遞能力及腫瘤特異性CTL效應(yīng)SOCS1SurvivinMuc1Flagellin中試放大急毒試驗(yàn)安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)人體細(xì)胞試驗(yàn)Ad5第二十頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞免疫治療的優(yōu)點(diǎn)體外活化、擴(kuò)增和修飾免疫細(xì)胞可選擇性的控制其GVL；增殖速度快、殺傷活性高、副作用小等優(yōu)點(diǎn)；體外培養(yǎng)繞過了體內(nèi)免疫系統(tǒng)中復(fù)雜的負(fù)調(diào)控系統(tǒng)的影響，活性更強(qiáng)；輸注免疫細(xì)胞可避免由于應(yīng)用大劑量的某些細(xì)胞因子引起的毒副反應(yīng)。第二十一頁(yè)，共41頁(yè)。面臨的問題為使制備的免疫細(xì)胞具有更好的GVL效應(yīng)，體外擴(kuò)增技術(shù)尚需進(jìn)一步研究和完善；治療方法尚不完善,對(duì)于治療時(shí)機(jī)、劑量、療程、給藥方法、挑選合適的佐劑及如何克服腫瘤免疫逃逸等方面均有許多尚待解決和完善的問題；針對(duì)白血病的免疫機(jī)制及細(xì)胞回輸后在體內(nèi)的作用機(jī)制尚未完全闡明，一些細(xì)胞免疫治療的療效還存在爭(zhēng)議。第二十二頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞免疫治療的不良反應(yīng)

免疫細(xì)胞是誘導(dǎo)、激活的自體細(xì)胞，這種治療相當(dāng)安全，有部分病例在細(xì)胞回輸后2-10個(gè)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)體溫升高（37.2℃～40℃），一般持續(xù)時(shí)間2～6小時(shí)，可自行緩解，極少數(shù)高熱病人使用解熱藥就可以完全緩解。第二十三頁(yè)，共41頁(yè)。研究方法及步驟

病人的選擇：急性白血病異基因移植后復(fù)發(fā)（包括形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)、分子學(xué)復(fù)發(fā)和細(xì)胞遺傳學(xué)復(fù)發(fā)）的患者。簽署治療知情同意書DC-CIK體外培養(yǎng)治療方法：4次DC，2次CIK。觀測(cè)指標(biāo)：臨床療效、治療前后免疫功能變化、治療前后細(xì)胞因子的變化。第二十四頁(yè)，共41頁(yè)。采集供者或患者抗凝全血50-60ml培養(yǎng)DC和CIK細(xì)胞回輸d7d9d11d13DCDCDCDCCIKCIK治療方法第二十五頁(yè)，共41頁(yè)。第二十六頁(yè)，共41頁(yè)。急性白血病異基因移植后復(fù)發(fā)17例，其中分子學(xué)復(fù)發(fā)9例，骨髓復(fù)發(fā)7例，中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病復(fù)發(fā)1例；細(xì)胞免疫治療異基因移植后復(fù)發(fā)的完全緩解率為82%,GVHD發(fā)生率為65%，均為Ⅱ度以下GVHD。臨床資料第二十七頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞免疫治療急性白血病移植后復(fù)發(fā)病例性別/年齡診斷供者CIK前治療GVHD臨床情況細(xì)胞治療后生存時(shí)間存活情況治療前治療后1F/35AML同胞NONO分子學(xué)復(fù)發(fā)CR＞14M＞29M2M/21AML無(wú)關(guān)格列衛(wèi)cGVHD分子學(xué)復(fù)發(fā)CR＞22M＞31M3M/31AML無(wú)關(guān)NoGVHD分子學(xué)復(fù)發(fā)CR＞17M＞21M4F/19ALL單倍體NoGVHD分子學(xué)復(fù)發(fā)CR＞10M＞27M5M/17AML無(wú)關(guān)NoNo分子學(xué)復(fù)發(fā)CR＞15M＞32M6F/28AML無(wú)關(guān)NoGVHD分子學(xué)復(fù)發(fā)CR-RL3M死亡7F/55AML同胞DSI腸道GVHD分子學(xué)復(fù)發(fā)復(fù)發(fā)6M死亡8M/61AML同胞NoGVHD分子學(xué)復(fù)發(fā)CR5M死亡9M/8AML無(wú)關(guān)+單倍體NoGVHD分子學(xué)復(fù)發(fā)CR＞14M＞34M10F/34MDS-AML同胞手術(shù)+放療+化療NO髓外復(fù)發(fā)CR＞26M＞73M11M/25ALL無(wú)關(guān)化療NO復(fù)發(fā)后CRCR＞40M＞64M12F/38AML同胞手術(shù)+放療+化療GVHD復(fù)發(fā)后CRCR＞31M＞129M13M/38ALL無(wú)關(guān)化療NO復(fù)發(fā)后CRCR＞8M＞26M14F/15AML單倍體化療GVHD復(fù)發(fā)后PR未緩解3M死亡15M/22ALL單倍體化療GVHD復(fù)發(fā)后NRCR-RL4M死亡16M/30AML同胞鞘注NOCNLNR＞17M＞35M17F/35M3-CR3同胞砷劑cGVHD復(fù)發(fā)CR＞13M＞59MDSI供者外周血造血干細(xì)胞輸注CR-RLCR后3個(gè)月骨髓復(fù)發(fā)病例9為第一次無(wú)關(guān)供者移植后2月復(fù)發(fā)，化療后未緩解，給予第二次單倍體移植后9月分子學(xué)復(fù)發(fā)病例12為移植后5年髓外復(fù)發(fā)，給予手術(shù)和局部放療，3個(gè)月后骨髓復(fù)發(fā)第二十八頁(yè)，共41頁(yè)。病例資料患者，女性，49歲2001.6診斷為急性髓性白血病M2DA方案化療1療程后獲CR，鞏固化療1療程2001.9HLA相合同胞外周血干細(xì)胞移植2009.6胸壁髓外復(fù)發(fā)手術(shù)切除+放療+細(xì)胞免疫治療2010.3髓外+骨髓復(fù)發(fā)，blast87.5%MA方案化療1療程獲CR此后予細(xì)胞免疫治療5次，持續(xù)CR狀態(tài)2012.5復(fù)查提示分子學(xué)復(fù)發(fā)，TA方案化療+細(xì)胞免疫治療，再次達(dá)CR。第二十九頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞免疫治療前后殘留變化DC+CIKTA方案化療第三十頁(yè)，共41頁(yè)。患者細(xì)胞免疫治療前后殘留變化無(wú)關(guān)供者移植移植后+10月自體細(xì)胞免疫治療+11月+15月+13月第三十一頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞免疫治療聯(lián)合化療治療粒細(xì)胞肉瘤一例孫某，男性，43歲；2011年9月以左頸部皮膚腫塊起病，活檢后病理經(jīng)江蘇省人民醫(yī)院、江蘇省腫瘤醫(yī)院、北京大學(xué)病理科會(huì)診，診斷為髓系肉瘤；先后接受DA、MA（2療程）、FLAG（2療程）方案共5療程化療，初始化療效果可，隨后化療效果不佳，化療后皮膚腫塊不消失；第三十二頁(yè)，共41頁(yè)。2012年5月28日就診我科；5月30日開始給予TA+VM-26方案化療，化療后輸注DC+CIK細(xì)胞；7月20日開始給予TA+VM-26方案化療，化療后輸注DC+CIK細(xì)胞；治療過程中骨髓始終未受累。第三十三頁(yè)，共41頁(yè)。5月30日6月15日7月16日8月21日化療化療第三十四頁(yè)，共41頁(yè)。5月30日6月15日7月16日8月21日第三十五頁(yè)，共41頁(yè)。AML自體移植聯(lián)合DC-CIK治療流程急性髓性白血病（中低危，M3除外）（留標(biāo)本）↓誘導(dǎo)化療↓完全緩解（無(wú)HLA相合供者）↓鞏固強(qiáng)化3-4個(gè)療程↓自體移植↓血象恢復(fù)（4周后）DC-CIK細(xì)胞治療第三十六頁(yè)，共41頁(yè)。急非淋自體骨髓移植后免疫治療結(jié)果（P=0.037)第三十七頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞免疫治療前后血清中細(xì)胞因子的對(duì)比

IFN-r（pg/ml）TNF-a（pg/ml）IL-10（pg/ml）IL-6（pg/ml）IL-4（pg/ml）IL-2（pg/ml）治療前7.08±2.554.20±3.273.80±0.787.53±4.107.72±3.246.25±0.60治療后88.62±196.5066.12±155.5826.36±55.0426.58±32.0149.75±99.7042.87±87.71P值0.480.890.120.040.160.05第三十八頁(yè)，共41頁(yè)。細(xì)胞治療前后淋巴細(xì)胞亞群的對(duì)比

CD3+CD4+CD8-（℅）CD3+CD4-CD8+（℅）CD3+CD19-（℅）CD3-CD19+（℅）CD3-CD56+（℅）CD3+CD56+（℅）CD3+HLA-DR-（℅）CD3+HLA-DR+（℅）CD3+CD28+CD8+（℅）CD3+CD4+CD25+（℅）治療前25.3±12.141.9±15.769.7±9.914.6±9.49.6±4.84.6±3.459.8±12.78.4±6.711.5±3.70.7±0.4治療后27.4±13.842.9.0±16.373.4±7.512.3±6.39.6±4.57.1±