武漢大學天然產(chǎn)物提取茯苓

主要內(nèi)容1.研究意義2.研究對象簡介3.主要成分4.主要成分提取流程5.分析方法6.研究新進展7.參考文獻第一頁，共29頁。1.研究意義茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf為常用中藥,性味甘淡,平,具有祛濕利水、健脾和胃、寧心安神的作用,用于治療小便不利,水腫脹滿,痰飲咳逆,嘔穢,泄瀉,遺精,淋濁,驚悸,健忘等。茯苓單用或與其他藥物配伍廣泛應(yīng)用于臨床,名醫(yī)洪竹書先生茯苓、甘草每方必用。茯苓在中醫(yī)臨床及人民生活中有著廣泛的使用價值。近些年來,國內(nèi)外對茯苓多糖、三萜類等成份及其藥理作用、生物活性方面作了較多的研究,并且有了較大的進展。從茯苓的藥理作用與社會、經(jīng)濟發(fā)展的眼光看,其開發(fā)的前景會越來越受世人的廣泛關(guān)注。第二頁，共29頁。2.研究對象簡介2.1歷史我國食用茯苓的歷史已有兩千多年?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將茯苓列為“上品”，稱其“久服安魂養(yǎng)神，不饑延年”。南朝醫(yī)學家陶弘景辭官隱退后，梁武帝即令“每月賜茯苓五斤，白蜜二斤，以供服餌”?？梢姰敃r茯苓被視為延壽珍品。唐宋時服食茯苓更加普遍，唐詩人賈島就有“二十年中餌茯苓，致書半是老君經(jīng)”之詩句。第三頁，共29頁。2.2茯苓植物形態(tài):常見者為其菌核體。多為不規(guī)則的塊狀，球形、扁形、長圓形或長橢圓形等，大小不一，小者如拳，大者直徑達20～30厘米，或更大。表皮淡灰棕色或黑褐色，呈瘤狀皺縮，內(nèi)部白色稍帶粉紅，由無數(shù)菌絲組成。子實體傘形，直徑0.5～2毫米，口緣稍有齒；有性世代不易見到，蜂窩狀，通常附菌核的外皮而生，初白色，后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈厣?，孔作多角形，擔子棒狀，擔孢子橢圓形至圓柱形，稍屈曲，一端尖，平滑，無色。有特殊臭氣。寄生于松科植物赤松或馬尾松等樹根上，深入地下20～30厘米。

第四頁，共29頁。2.3成品加工:茯苓出土后洗凈泥土，堆置于屋角不通風處，使其“發(fā)汗”，析出水分。然后取出，將水珠擦去，攤放陰涼處，待表面干燥后再行發(fā)汗。切制:于發(fā)汗后趁濕切制，亦可取干燥茯苓以水浸潤后切制。將茯苓菌核內(nèi)部的白色部分切成薄片或小方塊，即為白茯苓；削下來的黑色外皮部即為茯苓皮；茯苓皮層下的赤色部分，即為赤茯苓；帶有松根的白色部分，切成正方形的薄片，即為茯神。切制后的各種成品，均需陰干，不可炕曬，并宜放置陰涼處，不能過于干燥或通風.以免失去粘性。

第五頁，共29頁。3.主要化學成分茯苓的主要化學成分為:多糖、三萜、脂肪酸、甾醇、酶等。3.1多糖類:

茯苓主含β-茯苓聚糖(β-pachyman)約占干燥品的93%,是具有β-(1→6)吡喃葡萄糖為支鏈的(1→3)葡萄糖聚糖。另外還有茯苓次聚糖(pachymaran),木聚糖(xylam),μ-茯苓多糖f(μ-pachymanf),羧甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran,CMPA)。3.2三萜類:

從茯苓中分離出39種三萜,主要分為以下幾類:第六頁，共29頁。羊毛甾-8-烯型三萜類化合物(Lanosta-8-enetypetriterpenes)羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜類化合物(Lanosta-7,9(11)-dienetypetriterpenes)3,4-開環(huán)-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜(3,4-seco-lanostan-7,9(11)-dienetypetriterpenes)該類化合物僅存在于茯苓皮中

3.3甾醇類化合物(Sterol):甾醇類主要存在于茯苓的石油醚、乙醚提取部位,其中主要含有Ergosterol,Ergost-7-en-3β-ol,(22E)–Er-gosta-5,7,9(11),22-tetraen-3β-ol,Ergosta-5,7–di-en-3β-ol,(22E)-Ergosta-6,8(14),22-trien-3β-ol,(22E)-Ergosta-7,22-dien-3β-ol,(22E)-Ergosta-8(14),22-dien-3β-ol

第七頁，共29頁。3.4其他類化合物

辛酸(Caprylicacid),十一酸(Undecanoicacid),月桂酸(Lauricacid),十二酸(Dodecanoicacid),棕櫚酸(Palmiticacid)等;組氨酸,甲殼素,蛋白質(zhì),卵磷脂,左旋葡萄糖,腺嘌呤,膽堿,樹膠,脂肪及酶等;無機元素鈣,鎂,鐵,鉀,鈉,錳,磷,硫,硅,鉻,鎘,銅,鉛及氯。第八頁，共29頁。4.主要成分提取流程4.1茯苓多糖的提取:茯苓多糖的提取主要是使用溶劑提取法,如下:

⑴水提乙醇沉法

準確稱取茯苓500g,切成碎片,加入4～6倍量的水,回流提取3次,時間分別是3,2和1h。合并3次提取液濾過,除去不溶性雜質(zhì),得2000ml濾液。取600ml減壓蒸餾濃縮76ml,在攪拌下加入乙醇,使含醇量達到80%,靜置12h,離心,收集沉淀,加蒸餾水60ml溶解煮沸,趁熱濾除不溶物,濾液在攪拌下再加入乙醇,使含醇量達到80%,放置,析出褐色沉淀后,低溫干燥,即得茯苓多糖粗品。再經(jīng)過一定處理制得精品。第九頁，共29頁。⑵堿浸法提取茯苓多糖

用稀堿(1.0mol/l的NaOH)分別處理水提后的茯苓渣。把用水提后的茯苓渣分別用5倍量的堿液置于不同的溫度下泡4小時,此時溶液呈粘稠狀,離心得上清液Ⅰ,把渣再用3倍量的堿液提取一次,所得上清液Ⅱ與Ⅰ合并,抽濾,濾液以10%的醋酸液中和至pH=6,再加3倍量的95%的乙醇,于4℃放置過夜,離心沉淀,Smith降解,流水透析兩天,再依次用蒸餾水,無水乙醇,丙酮,乙醚洗滌后,真空干燥。第十頁，共29頁。第十一頁，共29頁。4.2茯苓三萜成分的提取與分離白茯苓1000g,用無水乙醇浸泡20h,過濾,濾液濃縮至干,得濃縮物8.17g,取8g用適量硅膠H吸附,加在裝有80g硅膠H的真空快速色譜柱(VLC)上,依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(v∶v=7∶3)和乙酸乙酯洗脫,得到不同極性的三部分,其中石油醚2乙酸乙酯部分濃縮后用20cm×20cm的硅膠GF254薄層板,在環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(v∶v∶v=6∶4∶0.5)中進行分離,甲醇重結(jié)晶得到晶(Ⅰ)3.4mg,晶(Ⅱ)14mg,晶(Ⅲ)25mg.21位羧基酯化衍生物Ⅰ1,Ⅰ2,Ⅱ1,Ⅱ2,Ⅱ5,Ⅲ1,Ⅲ2)的

制備取由真空快速層析柱上收集到的主含茯苓四環(huán)三萜(Ⅰ),(Ⅱ),(Ⅲ)的樣品500mg用150mL丙酮溶解,加入1g無水碳酸鉀和1mL1,2-二溴乙烷,回流4h后,熒光檢測.反應(yīng)液過濾,濃縮后用20cm×20cm的硅膠GF254薄層板,第十二頁，共29頁。在苯2石油醚2乙酸乙酯(v∶v∶v=3∶2∶1)溶劑系統(tǒng)中分離,甲醇重結(jié)晶,得目標物:(Ⅰ1)2.1mg,(Ⅱ1)4.8mg,(Ⅲ1)12mg.用同樣方法與1-溴-3-氯丙烷、1-碘丙烷反應(yīng)得目標物(Ⅰ2),(Ⅱ2),(Ⅱ5),(Ⅲ2).3位羥基酯化衍生物(Ⅱ3),(Ⅱ4),(Ⅲ3),(Ⅲ4)的制備:取(Ⅰ2)200mg,加入2mL吡啶和1mL醋酸酐,室溫攪拌24h后,用6mol/L鹽酸將反應(yīng)液調(diào)pH3左右,用乙酸乙酯提取,熒光檢測,將乙酸乙酯液濃縮,用20cm×20cm硅膠GF254薄層板,在苯-石油醚-乙酸乙酯(v∶v∶v=2∶2∶015)中進行分離,甲醇重結(jié)晶,得目標化合物(Ⅱ3)60mg,用同樣方法制得目標物(Ⅱ4),(Ⅲ3),(Ⅲ4).3,16位羥基氧化衍生物(Ⅲ5)的制備:取(Ⅲ2)250mg溶于20mL二氯甲烷中,加入吡啶嗡氯鉻酸鹽(PCC)600mg,室溫攪拌10h后,用20cm×20cm的硅膠GF254薄層板,在苯-石油醚-乙酸乙酯(v∶v∶v=3∶2∶1)中進行分離,甲醇重結(jié)晶,得目標物(Ⅲ5)100mg.第十三頁，共29頁。酮基肟化衍生物(Ⅰ3),(Ⅲ6)的制備:取(Ⅰ2)400mg溶于8mL無水乙醇中,加120mg鹽酸羥胺8mL吡啶,回流10h后,用6mol/L鹽酸將反應(yīng)液調(diào)pH3左右,用乙酸乙酯提取,熒光檢測,將乙酸乙酯液濃縮后,用20cm×20cm硅膠GF254薄層板,在苯-石油醚-乙酸乙酯(v∶v∶v=3∶2∶1)中進行分離,甲醇重結(jié)晶,得目標物(Ⅰ3),用同樣方法制得目標物(Ⅲ6).

晶(Ⅰ)、晶(Ⅱ)和晶(Ⅲ)經(jīng)元素分析、紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振氫譜及碳譜等分析以及與文獻對照,確定結(jié)構(gòu)如圖1所示.第十四頁，共29頁。第十五頁，共29頁。.

所制備的14個茯苓四環(huán)三萜衍生物均未見文獻報道,其結(jié)構(gòu)經(jīng)元素分析、紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜及核磁共振譜等確證無誤(見圖2,圖3).第十六頁，共29頁。第十七頁，共29頁。第十八頁，共29頁。5.分析方法5.1分光光度法測多糖的含量:

實驗原理:

多糖在強酸作用下水解生成單糖,并迅速脫水生成糠醛,糠醛與酚性物質(zhì)如苯酚縮合成有色化合物,反應(yīng)迅速,完全,有色物質(zhì)穩(wěn)定,并且有色物生成量與多糖濃度存在定量關(guān)系,這樣用分光光度法在適當波長處可以得到多糖含量。本法簡便快速,易行。第十九頁，共29頁。

試驗方法:

吸收波長的選擇:

精密吸取對照品溶液1.0ml,和供試品溶液1.0ml,分別置于20ml的試管中,各精密加入5%的苯酚液1.0ml,然后緩慢精密加入5.0ml濃硫酸,搖勻,放置30min后,在分光光度儀上測定波長從400～524nm之間的吸收度,兩者均在490nm處有最大吸收,故選擇490nm波長測定。

實驗條件的選擇:

根據(jù)實驗測得最佳反應(yīng)條件是:5%苯酚2.0ml,濃硫酸6.0ml,加酸后放置30min,反應(yīng)溫度為室溫。第二十頁，共29頁。

標準曲線的繪制:

精密量取葡萄糖對照品溶液0,0.1,0.2,0.4,0.5,0.6,0.7和0.8ml置于20ml試管中,分別加水至1.0ml再分別加入5%苯酚溶液2.0ml,等充分混合后,然后加入濃硫酸6.0ml,再充分混合,放置室溫,在490nm處測得吸收度分別為0.121,0.249,0.495,0.614,0.730,0.815和0.913。求得標準曲線的回歸方程:A=0.02282c+0.02453(r=0.9994,n=7)。

樣品含量測得:

吸取供試品溶液1.0ml3份,分別置于20ml試管中,加入5%苯酚溶液2.0ml,混合后加入濃硫酸6.0ml,放置30min,在490nm處分別測得其吸收度A值:A1=0.871,A2=0.872,A3=0.876,根據(jù)回歸方程求出百分含量為74.16%,74.27%和74.62%,平均含量74.35%。第二十一頁，共29頁。5.2茯苓三萜成分的鑒定紅外光譜

紅外光譜用于三萜類化合物的結(jié)構(gòu)測定,主要根據(jù)區(qū)域A(1355～1692cm-1)和區(qū)域B(1245～1330cm-1)的碳氫吸收來區(qū)別四環(huán)三萜型和其它類型.四環(huán)三萜的A,B區(qū)各有一個峰,而齊墩果烷型和烏索烷型在A區(qū)或B區(qū)都有2個或3個峰.

紫外光譜

茯苓中羊毛脂甾烷型和3,4開環(huán)羊毛脂甾烷型三萜化合物的21個成分中,只有化合物(1),(3),(8)和(10)的環(huán)上雙鍵為8位雙鍵,其它17個均為7,9(11)異環(huán)雙烯,這在茯苓三萜化學成分的紫外光譜分析中極為有用,且在紫外光譜的242(或243,244)nm處有最大吸收,吸光系數(shù)一般在10000以上.

第二十二頁，共29頁。質(zhì)譜:在三萜類化合物的結(jié)構(gòu)測定中,質(zhì)譜分析具有重要地位.不同母核的三萜類化合物均有各自的裂解特征,并遵循一定的規(guī)律,產(chǎn)生一系列特征的碎片離子峰.

核磁共振譜

1HNMR譜中主要信號來自雙鍵質(zhì)子,連氧碳質(zhì)子和甲基質(zhì)子,而13CNMR譜中信號一般來源于環(huán)內(nèi)和環(huán)外雙鍵碳原子,且所處位置不同,其碳原子化學位移亦有明顯差別,一般不受取代基團的影響,以此判斷其母核骨架類型、雙鍵位置和解決某些立體化學問題.第二十三頁，共29頁。6.研究新進展6.1茯苓聚糖

茯苓多糖體具有增強免疫功能的作用。它具有抗胸腺萎縮及抗脾臟增大和抑瘤生長的功能。羧甲基茯苓多糖還是免疫調(diào)節(jié)、保肝降酶、間接抗病毒、誘生和促誘生干擾素、減輕放射副反應(yīng)、誘生和促誘生白細胞調(diào)節(jié)素等多種生理活性,無不良毒副作用。有實驗證明,茯苓多糖確有針對性地保護免疫器官,增加細胞免疫功能,從而改善機體狀況,增加抗感染能力,尤其對老年人免疫功能有較強作用。另外茯苓聚糖還具有抗腫瘤作用和防石作用。最近有實驗證實,茯苓多糖能有效抑制大鼠腎內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的形成和沉積,具有較好的防石作用。Roberton等認為,尿液中主要抑制結(jié)石形成的物質(zhì)是酸性粘多糖。但茯苓多糖的防石作用機制是否與酸性粘多糖一致,有待進一步研究證實。第二十四頁，共29頁。茯苓多糖及其衍生物(羧甲基茯苓多糖、羧甲基茯苓聚糖等)的開發(fā)應(yīng)用,目前還處于研究階段,以茯苓多糖衍生物作添加劑制成茯苓飲料的工作,目前已有人開始進行。由于羧甲基茯苓多糖、羧甲基茯苓聚糖同羧甲基淀粉鈉(CMS)一樣具有水溶性和增稠性,由此可配制成茯苓系列保健食品。如茯苓冰淇淋、茯苓奶油蛋糕、茯苓果醬等。還可同固體飲料如豆?jié){晶、菊花晶、麥乳晶、果汁晶配伍制成茯苓系列飲料。在醫(yī)學上,茯苓多糖對肝炎、鼻咽癌和胃癌等患者有一定的療效,能增強機體的免疫功能,特別引人注目的是羧甲茯苓多糖不僅是低濃度干擾素的誘生劑,而且是理想的干擾素促生劑,可提高單位細胞干擾素的產(chǎn)量。據(jù)近期的研究報道,發(fā)現(xiàn)茯苓中含有微量抗癌元素有機鍺。湖北省化學研究所與海南應(yīng)用技術(shù)研究所合作,正在開發(fā)一種茯苓花生奶茶,試制研究表明,該飲料酸甜適口、營養(yǎng)豐富、性能穩(wěn)定,是一種新型的天然飲品,已引起不少廠家的興趣。第二十五頁，共29頁。6.2三萜類成分

抗腫瘤作用茯苓素體外對小鼠白血病L210細胞的DNA合成有明顯不可逆的抑制作用,可顯著抑制L1210C的核苷轉(zhuǎn)運,抑制L1210DNA合成的補償途徑的各個環(huán)節(jié),對胸苷激酶有一定抑制作用。且茯苓素對抗癌藥有一定增效作用。茯苓素在體內(nèi)外均有明顯增強巨噬C產(chǎn)生誘生腫瘤壞死因子的能力。

抗炎作用茯苓由三萜1和12作為蛇毒液的磷脂酶A2(PLA2)的抑制劑,PLA2可抑制多種炎癥過程。

止吐作用茯苓三萜及其衍生物抑制蛙口服五水CuSO4引起的嘔吐。實驗證明,側(cè)鏈上C-24位具有末端雙鍵基團的三萜顯示對蛙有止吐作用。第二十六頁，共29頁。

茯苓三萜類成分除了具有上述功效外還具有增強免疫功能,利尿等作用。近年來,國內(nèi)學者對傳統(tǒng)中藥茯苓應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學的實驗研究與臨床觀察方法和手段進行了深入廣泛的研究,進一步探明了茯苓許多與現(xiàn)代醫(yī)學相關(guān)而原來未知的功效。

6.3茯苓作為食品

其發(fā)展也相當迅猛,很早以前,我國食用茯苓就有“南糕北餅”的傳統(tǒng)習慣。茯苓食品的一些品種在我國曾一度失傳。近年來隨著食品療法的重新興起,茯苓食品也得到了發(fā)展,許多茯苓食品相繼問世。在北京可以買到茯苓夾餅,崇文門外的應(yīng)市早點中還有“茯苓豆沙包子”。由白茯苓、糯米、芝麻、油茶、白糖精制成的湖南茯苓糕,由于