試論他汀類藥物對神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞ABCA1基因表達的影響的論文

試論他汀類藥物對神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞ABCA1基因表達的影響的論文【內(nèi)容內(nèi)容摘要】目的觀察他汀類藥物對神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞atp結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運體1(atpbindingcassettetransporter1,abca1)基因表達的影響。方法培養(yǎng)人類神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別加入不同濃度的辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀(pravastatin)，孵育不同時間后分別提取細(xì)胞總rna和胞質(zhì)蛋白，rtpcr觀察abca1基因的表達，westernblot檢測abca1蛋白。結(jié)果辛伐他汀和普伐他汀組顯著降低了abca1基因和蛋白的表達，其中辛伐他汀的作用比普伐他汀明顯(辛伐他汀對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞abca1基因表達分別降低95%和75%p0.05)，神經(jīng)元實驗組比神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組更為敏感。結(jié)論他汀類藥物可以顯著降低神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞abca1基因和蛋白的表達，abca1的降低有可能影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝，對全面評價他汀類藥物對高血脂相關(guān)基因的影響及用藥安全性提供了一定的實驗依據(jù)。【本文本文關(guān)鍵詞語語】atp結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運體1;辛伐他汀;普伐他汀abstract:objectivetoobservetheeffectsofstatinsonatpbindingcassettetransporter1(abca1)geneexpressioninneuronsandastrocytes.methodsprimaryhumanastrocytesandneuroncelllinehcn2wereincubatedwithsimvastatinandpravastatinatdifferentconcentrationsandunderdifferentconditions.usingrnaisolatedfromtheculturedcells,paredwithpravastatin,simvastatinsignificantlyreducedtheexpressionofabca1inneuronsandastrocytesby95%and75%,respectively(bothp0.05).theneuronsweremoresensitivethanastrocytes.conclusionthestatinsarecapableofdecreasingtheabca1geneandproteinexpressionsinneuronsandastrocytes,anddecreasedabca1expressionmayaffectcholesterolmetabolismincells.theresultsmayprovideanimportantexperimentalbasisforcomprehensiveevaluationofthestatinstotreathyperlipidemia.keywords:atpbindingcassettetransporter1(abca1);simvastatin;pravastatin他汀類藥物是臨床常用的一類降血脂藥物[12]，其主要成分為膽固醇合成限速酶羥甲戊二酰輔酶a(hmgcoa)還原酶的抑制劑。11665.coM辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀(pravastatin)已廣泛應(yīng)用于高血脂癥的臨床治療。由于該藥阻斷甲羥戊酸的生化途徑，不但能抑制膽固醇的合成、降低血漿ldl的水平、阻止巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，而且可以顯著降低因高血脂引起的動脈粥樣硬化性疾病的死亡率[3]。除此之外，研究表明，他汀類藥物還可以升高血漿高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,hdl)和載脂蛋白a。atp結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運體1(atpbindingcassettetransporter1,abca1)是atp結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運蛋白之一，它以atp為能源，促進細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(rct)和hdl生成的起始步驟中起重要作用。abca1基因錯義突變所引起的雜合子型tangier疾病，就是由于apoai所介導(dǎo)的膽固醇流出減少、hdlc濃度降低和顆粒直徑變小而造成[4]。作為潛在的抗粥樣硬化的靶點之一，上調(diào)abca1基因的表達具有重要意義。apoai是hdl中主要的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的特殊重要因素。apoai能與磷脂、多種血漿因子及細(xì)胞膜受體結(jié)合,可以激活卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(lcat)，起著促進細(xì)胞內(nèi)膽固醇的移出、酯化、轉(zhuǎn)移、以及調(diào)節(jié)hdl代謝的作用[5]。以往學(xué)者認(rèn)為，他汀類藥物可能對老年癡呆癥有一定的預(yù)防作用[6]。但是，近年來有關(guān)他汀類藥物可能導(dǎo)致老年癡呆癥或者加重原有癥狀的報道越來越多[79]。當(dāng)下，有關(guān)他汀類藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)abca1基因的影響還未見報道。本實驗通過觀察辛伐他汀、普伐他汀對正常神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中abca1基因表達的影響，初步解釋了他汀類藥物有可能造成患者老年癡呆癥的發(fā)生或者癥狀加重的原因，為進一步揭示他汀類藥物的作用機制及其與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的關(guān)系打下一定的基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料神經(jīng)細(xì)胞系hcn2(crl10742)購自美國atcc公司，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系為本實驗室保存。辛伐他汀、普伐他汀、甲羥戊酸、fpp和ggpp均購自sigma公司。rna提取試劑盒購自美國qiagen公司。memper真核細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒購自美國pierce公司。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別用含有150ml/l和50ml/l胎牛血清的dmem培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合成片，胰酶消化后分別轉(zhuǎn)入12孔板內(nèi)，放入50ml/lco2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)觀察，待細(xì)胞生長成片時，用不含血清的培養(yǎng)基分別配置5μmol/l的辛伐他汀、20μmol/l普伐他汀、100μmol/l甲羥戊酸、10μmol/l的fpp、10μmol/lggpp，充分混勻。分別設(shè)立空白對照組、辛伐他汀實驗組(s)、普伐他汀實驗組(p)、辛伐他汀+甲羥戊酸實驗組(sm)、普伐他汀+甲羥戊酸實驗組(pm)、辛伐他汀+fpp實驗組(sf)、普伐他汀+fpp實驗組(pf)、辛伐他汀+ggpp實驗組(sg)、普伐他汀+ggpp實驗組(pg)。放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。1.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)離心收集細(xì)胞，預(yù)冷pbs洗滌1次后用qiagen試劑盒提取細(xì)胞總rna。取1μg細(xì)胞總rna，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5μl，rnasin(40u/μl)20u，10mol/l4×dntps2μl，用depc處理的h2o補足至23μl?；旌暇鶆蚝笥?0℃反應(yīng)5min，加入2μl反轉(zhuǎn)錄酶，37℃反應(yīng)1h后，90℃熱滅活5min，置-20℃貯存?zhèn)溆谩?.2.3熒光定量rtpcr檢測abca1的表達采用abiprism7700sequencedetector熒光定量pcr儀，以18s為內(nèi)參。反應(yīng)體系如下：吸取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物5μl，上、下游引物各10pmol/l，熒光探針5pmol/l，5×pcr緩沖液10μl，10mol/l4×dntps1μl，taqdna聚合酶1.5μl(2u/μl)，用滅菌純水補足至50μl，在pe7000(美國abi公司)上，93℃預(yù)變性3min后按如下條件進行循環(huán)：93℃30s，55℃45s，72℃20s，共40個循環(huán)。設(shè)置陰性對照和陽性梯度對照，實驗結(jié)果由電腦軟件分析。引物序列如下，f：5′tggttctatgcccgcttga3′;r：5′accttagatcccccgacaaag3′。1.2.4westernblot方法測定神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中abca1蛋白的變化離心收集細(xì)胞，預(yù)冷pbs洗滌1次后，用memper真核細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞膜蛋白。采用biorad公司的垂直電泳裝置電泳，并用半干法轉(zhuǎn)膜。雜交按照kpl公司的proteindetectortwesternblotkit說明進行。abca1一抗購自novus公司。1.3統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗數(shù)據(jù)以±s表示，使用statistica軟件(美國，statsoftinc)分析。采用mannwhitneyu檢驗和t檢驗，p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。宮惠琳，李擴，張冠軍，等.他汀類藥物對神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞abca1基因表達的影響2結(jié)果2.1神經(jīng)元實驗組rtpcr和westernblot結(jié)果他汀類藥物組與實驗對照組相比，abca1基因的表達降低(其中辛伐他汀降低abca1基因達95%)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。加入mevalonate后，可以部分減弱辛伐他汀和普伐他汀的作用。但是，ggpp組、fpp組與他汀類實驗組比較無顯著性差異(圖1);westernblot結(jié)果顯示，在加入相同量的蛋白時，他汀類實驗組的abca1蛋白表達顯著降低(圖2)。2.2神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞實驗組rtpcr和westernblot結(jié)果他汀類藥物組與實驗對照組相比，abca1基因的表達降低(其中辛伐他汀降低abca1基因75%)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)，但加入mevalonate、ggpp和fpp后，與他汀類實驗組相比較無顯著性差異(圖3);westernblot結(jié)果顯示，在加入相同量的蛋白時，他汀類實驗組abca1蛋白表達降低(圖4)。3討論他汀類藥物(statins)作為一種非常有效的降膽固醇、降血脂藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床，總體藥效評價較好。以往研究認(rèn)為，該藥物可以降低血脂、降低心腦血管疾病的發(fā)病率、預(yù)防老年癡呆癥的發(fā)生。但近年來研究提示，長期大劑量服用該藥物可能造成腦細(xì)胞暫時性或者永久性的損傷，有些患者反而出現(xiàn)老年癡呆癥的表現(xiàn)[79]。這種現(xiàn)象日益引起人們的重視。本研究證實使用他汀類藥物能顯著降低神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)abca1基因的表達，引起腦內(nèi)膽固醇代謝異常，進而揭示了他汀類藥物有可能是引起老年癡呆癥的原因。膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(rct)是指hdl從肝外組織將膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟進行代謝。通過這種機制，機體可將外周組織衰老細(xì)胞膜中的膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟代謝并排出體外。膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運是一個由hdl介導(dǎo)，在膽固醇酯化酶、lcat共同作用下完成的多步驟過程[10]。abca1是一種整合膜蛋白。abca1基因位于常染色體9q31上。它所編碼的蛋白稱為abca1蛋白，屬于atp結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運體(atpbindingcassettetransporter,abc)基因家族的一員。abca1廣泛分布于人體多種組織，在胎盤、肝臟、肺、腎上腺和嬰兒組織內(nèi)高水平表達。在正常主動脈血管中沒有發(fā)現(xiàn)abca1的表達，而在動脈粥樣硬化的血管中則有該基因的表達[1112]。以往研究表明，肝臟和巨噬細(xì)胞abca1過表達與血漿脂質(zhì)水平有密切關(guān)系，血漿膽固醇從巨噬細(xì)胞流出及血漿中hdl明顯增加可大大減輕動脈粥樣硬化的損傷[13]。臨床研究表明，辛伐他汀和普伐他汀對大腦中載脂蛋白e(apoe)和磷脂蛋白轉(zhuǎn)移蛋白(pltp)的作用有所不同：辛伐他汀可以顯著降低腦脊液中pltp的活性，而普伐他汀卻無此類作用;相反，普伐他汀使腦脊液中apoe水平下降明顯，而辛伐他汀的作用卻不明顯[14]。由于血腦屏障的影響，兩種他汀類藥物進入血腦屏障的能力有所不同。辛伐他汀為脂溶性，較易透過血腦屏障;而普伐他汀為水溶性，透過血腦屏障較為困難。因此，本實驗直接用神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為研究對象，去除了血腦屏障的影響，從而更為直觀地研究兩種常用的他汀類藥物對膽固醇逆向運輸相關(guān)基因的影響。實驗結(jié)果顯示，去除了血腦屏障對他汀類藥物的影響，辛伐他汀和普伐他汀對神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的作用有很大的不同。辛伐他汀可以顯著降低神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)abca1基因的表達，尤其是對于前者，可使abca1的基因表達降低約95%;而普伐他汀對兩者abca1基因表達影響較弱。另外，加入mevalonate后，在神經(jīng)元中他汀類藥物降低abca1基因表達的能力下降，而加入ggpp和fpp后，他汀類藥物降低abca1基因表達的能力沒有改變;在膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)則有所不同，加入mevalonate、ggpp和fpp后，abca1基因的表達幾乎沒有改變。以上說明了他汀類藥物對神經(jīng)元abca1基因表達的影響比對膠質(zhì)細(xì)胞更為顯著，并且有可能是通過減少mevalonate的產(chǎn)生這一途徑來實現(xiàn)的。研究表明，abca1基因可以促進膽固醇流出轉(zhuǎn)運至血漿中形成新生hdl，從而使它成為降低膽固醇，防止動脈粥樣硬化的重要因子。在本實驗中，他汀類藥物顯著降低神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞abca1基因的表達，對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的膽固醇代謝產(chǎn)生嚴(yán)重影響，進而造成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的變性、死亡。這是長期使用他汀類藥物影響患者認(rèn)知能力和記憶能力的原因之一。本研究有助于更深入地了解該藥物的作用機制及其不良反應(yīng)，為進一步認(rèn)識脂代謝異常與老年癡呆癥的相互關(guān)系提供了一定的實驗依據(jù)。在細(xì)胞學(xué)水平進一步證實了長期大劑量使用他汀類藥物可能對神經(jīng)系統(tǒng)造成的不良影響，提示長期服用他汀類藥物的患者要特別注意用藥類型、時間和用藥劑量?！疽韵聻橐韵聻閰⒖嘉墨I】[1]wernern,nickenigg,laufsu.pleiotropiceffectsofhmgcoareducateseinhibitors[j].basicrescardiol,2002,97(2):106116.[2]miidat,hirayamas,nakamuray.cholesterolindependenteffectsofstatinsandnewtherapeutictargets:ischemicstrokeanddementia[j].jatherosclerthromb,2004,11(5):253264.[3]auerj,berentr,eberb.lessonslearnedfromstatintrials[j].clincardiol,2001,24(4):277280.[4]brousseaume,eberhartgp,dupuisj,etal.cellularcholesteroleffluxinheterozygotesfortangierdiseaseismarkedlyreducedandcorrelateswithhighdensitylipoproteincholesterolconcentrationandparticlesize[j].jlipidres,2000,41(7):11251135.[5]schaeferjr,schweerh,ikewakik.metabolicbasisofhighdensitylipoproteinsandapolipoproteinaiincreasebyhmgcoareductaseinhibitioninhealthysubjectsandapatientwithcoronaryarterydisease[j].atherosclerosis,1999,144(1):177184.[6]kurinamih,saton,shinoharam,etal.preventionofamyloidbetainducedmemoryimpairmentbyfluvastatin,associatedwiththedecreaseinamyloidbetaaccumulationandoxidativestressinamyloidbetainjectionmousemodel[j].intjmolmed,2008,21(5):531537.[7]orsia,shermano,woldesekassiez.simvastatinassociatedmemoryloss[j].pharmacotherapy,2001,21(6):767769.[8]kingds,wilburnaj,woffordmr,etal.cognitiveimpairmentassociatedwithatorvastatinandsimvastatin[j].pharmacotherapy,2003,23(12):16631667.[9]wagstafflr,mittonmw,arvikbm,etal.statinassociatedmemoryloss:analysisof60casereportsandreviewoftheliterature[j].pharmacotherapy,2003,23(7):871880.[10]phillipsmc,gillottekl,haynesmp.mechanismsofhighdensitylipoprot