干細胞和干細胞治療

干細胞和干細胞治療第1頁/共54頁2干細胞

stemcell未分化細胞自我更新

(self-renew)無限增殖體外長期培養(yǎng)多向分化潛能

(multipotential)第2頁/共54頁3第3頁/共54頁4干細胞的類型：

胚胎干細胞embryonicstemcells

胚胎干細胞主要是指來自囊胚內(nèi)細胞團的細胞，有自我更新和多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個胚層的各類細胞。成體干細胞

adultstemcells

成體干細胞是處于干細胞狀態(tài)的成體細胞，包括成年和未成年動物組織中的各種干細胞，因此又稱為組織干細胞。如神經(jīng)干細胞、造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、上皮干細胞、肝干細胞、胰腺干細胞等。第4頁/共54頁5胚胎干細胞embryonicstemcells（ES細胞）第5頁/共54頁6胚胎早期發(fā)生：囊胚形成

（囊胚內(nèi)細胞團）第6頁/共54頁7排卵、早期胚胎發(fā)生

(囊胚形成)第7頁/共54頁8胚胎干細胞的分離和建系

將囊胚內(nèi)細胞團的細胞通過體外培養(yǎng)產(chǎn)生未分化的細胞克隆，建立胚胎干細胞系1981年Evans和Martin首次成功分離和建立小鼠胚胎干細胞系1998年Thomson等首次成功分離和建立人胚胎干細胞系胚胎干細胞可在體外誘導(dǎo)分化形成各種成體細胞第8頁/共54頁9胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化外源誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)ES細胞分化

誘導(dǎo)因子：維甲酸(RA)、骨形成蛋白BMPs)、成纖維細胞生長因子(FGFs)等轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ES細胞分化

用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使某種促分化基因在ES細胞中表達、調(diào)節(jié)其分化與其他細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)ES細胞分化

創(chuàng)造細胞分化的微環(huán)境第9頁/共54頁10胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化第10頁/共54頁11成體干細胞adultstemcells又稱組織干細胞tissuestemcells第11頁/共54頁12成體干細胞的概念成體干細胞又稱組織干細胞，傳統(tǒng)的觀念認為它們是存在于成體組織的未分化細胞，現(xiàn)在認為也包括未成年動物的組織干細胞，它們具有不斷增殖和自我更新能力、又具有多向分化潛能。

如造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、上皮干細胞、胰腺干細胞、肝干細胞等第12頁/共54頁13成體干細胞的功能自然條件下成體干細胞傾向于分化成所在組織的細胞，參與組織更新和損傷修復(fù)；外界條件誘導(dǎo)下成體干細胞可橫向分化成其他組織的細胞，參與這些組織的損傷修復(fù)。第13頁/共54頁14造血干細胞的分化第14頁/共54頁15表皮干細胞的分化第15頁/共54頁16

干細胞應(yīng)用前景細胞治療組織工程藥物篩選發(fā)育研究基因功能研究第16頁/共54頁17

細胞治療

celltherapy

細胞治療是指將正?；蜻z傳改造過的人體細胞直接移植或輸入患者體內(nèi)，以達到替代受損細胞、治療疾病的目的。利用干細胞及其分化細胞進行細胞治療是干細胞臨床應(yīng)用的重要研究方向。

胚胎干細胞和成體干細胞都能用于細胞治療，但目前只有少數(shù)成體干細胞在細胞治療上己開始取得臨床療效，大多數(shù)的干細胞治療還在實驗階段。第17頁/共54頁18血液病的細胞治療如白血病的細胞治療

造血干細胞移植：自體移植（臍帶血造血干細胞）無排斥反應(yīng)同系移植（同卵孿生之間骨髓造血干細胞）一般無排斥反應(yīng)同種移植（人與人之間骨髓造血干細胞）有排斥反應(yīng)（供、受者組織相容性抗原不同）

需組織配型、選擇供者（骨髓庫）；抑制受者的免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)免疫耐受。

第18頁/共54頁19神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞治療如帕金森氏病細胞治療胚胎干細胞細胞移植神經(jīng)干細胞細胞移植

1、干細胞直接移植

2、誘導(dǎo)分化成相應(yīng)神經(jīng)細胞（多巴胺能神經(jīng)元）后進行細胞移植

第19頁/共54頁20心肌疾病的細胞治療如心肌梗塞的細胞治療

胚胎干細胞誘導(dǎo)分化成心肌細胞細胞移植成體干細胞（骨髓基質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、心肌干細胞等）誘導(dǎo)分化成心肌細胞細胞移植第20頁/共54頁21干細胞治療中的難點異體移植的免疫排斥反應(yīng)解決途徑：自身體細胞核移植（治療性克?。└杉毎蚋脑觳捎米陨砀杉毎闪鲂缘奈ｋU胚胎干細胞植入動物體內(nèi)會形成畸胎瘤，如何防止干細胞移植后可能因分化不徹底形成腫瘤，是必須解決的問題。解決途徑：完善定向誘導(dǎo)分化方法改進篩選純化技術(shù)第21頁/共54頁22治療性克隆

（體細胞核移植）

第22頁/共54頁23我們實驗室的一項工作胰腺干細胞的β細胞分化與I型糖尿病的干細胞治療第23頁/共54頁24

I型糖尿病的治療外源胰島素治療胰腺或胰島移植干細胞治療：

胚胎干細胞誘導(dǎo)分化成β細胞細胞移植基因?qū)胧蛊浔磉_胰島素細胞移植胰腺干細胞誘導(dǎo)分化成β細胞細胞移植第24頁/共54頁25胰腺干細胞的標志

1990年，Lendahl等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞中存在一種新的中間絲蛋白—巢蛋白（nestin），現(xiàn)在nestin已是公認的神經(jīng)干細胞標志之一。

2000年，Hunziker和Stein發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管和胰島中也存在nestin陽性細胞。

2001年，Zulewski等人從胰腺中分離到nestin陽性細胞，將其命名為NIPs（nestin-positiveislet-derivedprogenitorcells），并發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能(multipotential)，在體外可自發(fā)形成類胰島細胞團（islet-likecellclusters,ICCs）.

因此，人們相信nestin可能也是胰腺干細胞的標志。但是，NIPs是否確實是胰腺干細胞，能否用于細胞治療必須進一步證實。2001年起，我們?yōu)榇俗隽艘稽c實驗。

第25頁/共54頁26我們的實驗:人胎胰腺

nestin陽性細胞的分離、體外培養(yǎng)和生物學特性檢測（目的是確認NIPs是胰腺干細胞）；體外誘導(dǎo)分化NIPs形成能產(chǎn)生胰島素的β細胞；類胰島細胞團(ICCs)異種體內(nèi)移植—

糖尿病的干細胞治療實驗研究。第26頁/共54頁27

第一個實驗：人胎胰腺nestin陽性細胞(NIPs)的分離、體外培養(yǎng)和生物學特性檢測第27頁/共54頁28人胎胰腺的nestin陽性細胞的分布

免疫組化技術(shù)顯示nestin陽性細胞

nestin陽性細胞位于胰腺小導(dǎo)管壁及其相連的原始細胞團第28頁/共54頁分離胎胰導(dǎo)管和細胞團

在EHAA培養(yǎng)液（含2%FBS）中進行原代培養(yǎng)

在EHAA培養(yǎng)液中的胎胰導(dǎo)管和細胞團

培養(yǎng)48小時后細胞貼壁并開始鋪開第29頁/共54頁CK19

insulinnestin貼壁細胞鑒別：是否存在NIPs

免疫熒光染色檢測CK19、胰島素、nestin陽性細胞

呈CK19陽性的胰腺上皮細胞（細胞較大)

呈胰島素陽性的

β細胞（細胞較?。﹏estin陽性細胞(NIPs)（梭形）第30頁/共54頁31

NIPs的篩選培養(yǎng)和體外擴增

貼壁細胞在無糖低血清條件培養(yǎng)液中篩選培養(yǎng)NIPs

4周后大部分細胞死亡、僅存少量梭形細胞(NIPs)

DMEM/F12培養(yǎng)液中加生長因子bFGF促進梭形細胞(NIPs)體外擴增。亞克隆純化、傳代培養(yǎng)圖為由單個梭形細胞(NIPs)的掃描電鏡照片梭形細胞(NIPs)可在體外長期傳代培養(yǎng)第31頁/共54頁

NIPs的干細胞表型確定

免疫組化在蛋白質(zhì)水平檢測nestin表達

半定量RT-PCR在mRNA水平檢測nestin和干細胞標志基因ABCG2表達

nestin

semiquantitativeRT-PCR篩選培養(yǎng)的梭形細胞(NIPs)集落免疫組化顯示篩選培養(yǎng)的細胞均呈nestin陽性反應(yīng)半定量RT-PCR顯示篩選培養(yǎng)的細胞表達nestin和ABCG2第32頁/共54頁nestin

NIPs達到80%鋪滿時可自發(fā)形成小的ICCsNIPs能自發(fā)形成類胰島細胞團(ICCs).NIPs在DMEM培養(yǎng)液(含11.1mM葡萄糖、10%FBS和20ng/mlbFGF)中培養(yǎng)免疫組化顯示這種ICCs主要由nestin陽性細胞組成RT-PCR顯示這種ICCs高水平表達ABCG2和nestin

RT-PCRanalysis第33頁/共54頁

培養(yǎng)2周后形成的ICCs大而致密glucagon

NIPs具有多向分化潛能培養(yǎng)液中撤去bFGF使NIPs分化RT-PCRanalysis免疫組化顯示此時ICCs表達glucagonRT-PCR顯示此時ICCs有多種譜系基因的表達，具有向胰腺多種類型細胞分化的能力第34頁/共54頁35這一實驗結(jié)果表明：NIPs表達干細胞標志ABCG2，能長期培養(yǎng)，有多向分化潛能，在細胞形態(tài)、生長行為和分化潛能上具有干細胞特征，因此可以認為是胰腺干細胞.

ABCG2是ABC運輸?shù)鞍祝ˋTPbindingcassettetransporter）家族成員，其功能是將細胞內(nèi)的促分化因子泵出細胞以維持干細胞的未分化狀態(tài)，現(xiàn)在認為它是干細胞狀態(tài)決定因子。已有報道ES細胞、造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、肌干細胞等均表達ABCG2。第35頁/共54頁36

第二個實驗：

體外誘導(dǎo)分化NIPs形成產(chǎn)生胰島素的β細胞；第36頁/共54頁

培養(yǎng)10天后形成很多大而致密的ICCsinsulin誘導(dǎo)NIPs形成β細胞

NIPs在含高濃度葡萄糖(16.5mM)和多種誘導(dǎo)因子(IGF,HGF,betacellulinandnicotinamide)的DMEM

培養(yǎng)液中培養(yǎng)

RT-PCRanalysis免疫組化顯示ICCs中有胰島素陽性的β

細胞此時ICCs表達β

細胞的標志，但仍少量表達NIPs和其他細胞的標志第37頁/共54頁38ICCs的細胞內(nèi)胰島素含量

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測定ICCs的細胞內(nèi)胰島素含量β細胞誘導(dǎo)分化后的ICCs(ICC3)細胞內(nèi)胰島素含量明顯高于多向分化的ICCs(ICC2)，但仍低于胎胰胰島(islet)的胰島素含量第38頁/共54頁

insulinsecretioninresponsetoglucose

葡萄糖或促分泌素對ICCs分泌胰島素的作用

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測定ICCs分泌胰島素量

T:tolbutamideC:carbacholG:GLP-1

insulinsecretioninresponsetosecretagogues在不同濃度葡萄糖刺激下ICCs中β細胞胰島素分泌量與萄葡糖濃度呈正相關(guān)各種分泌刺激因子刺激ICCs釋放胰島素。T--甲苯磺丁脲C--碳酰膽堿G--胰高血糖素樣肽第39頁/共54頁40

這一實驗結(jié)果表明：NIPs具有多向分化潛能，在一定條件下能定向分化為功能性β細胞.

第40頁/共54頁41

第三個實驗：

類胰島細胞團(ICCs)異種體內(nèi)移植—

糖尿病的干細胞治療實驗研究。

（將定向誘導(dǎo)人NIPs形成含β細胞的ICCs

移植到嚴重聯(lián)合免疫缺失小鼠體內(nèi)）第41頁/共54頁42糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射鏈脲佐菌素STZ)

腎膜下移植ICCs治療糖尿病NOD-Scid小鼠腹腔內(nèi)注射streptozotocin腎膜下移植含類β細胞的ICCs高血糖

注射STZ前注射STZ后

移植ICCS后

302010

血糖水平(mmol/l)

注射后3天小鼠出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖癥

移植4天后小鼠血糖明顯下降第42頁/共54頁

insulin糖尿病小鼠腎膜下移植ICCs后形態(tài)觀察

免疫組化方法檢測含胰島素細胞

左腎移植部位

移植后40天，移植部位血管增生免疫組化顯示移植部位的胰島素陽性細胞第43頁/共54頁移植ICCs后血糖明顯下降(P<0.05)

糖尿病小鼠腎膜下移植ICCs后血糖水平測量STZ處理3天后所有NOD-Scid小鼠出現(xiàn)高血糖，移植4天后小鼠血糖水平下降至接近正常并保持穩(wěn)定至40天，未移植的小鼠保持高血糖。第44頁/共54頁

移植40天后，移植物在移植部位發(fā)生異常增殖并侵入腎實質(zhì)，形成導(dǎo)管、細胞團、血管等結(jié)構(gòu)。正常NOD-Scid小鼠腎膜下移植ICCs

移植部位的組織切片H.E染色第45頁/共54頁

腎膜下區(qū)域侵入腎實質(zhì)區(qū)域

**renaltubule

正常NOD-Scid小鼠腎膜下移植ICCs

移植部位透射電鏡觀察

可見導(dǎo)管和細胞團

腎小管附近可見導(dǎo)管和血管第46頁/共54頁47

這一實驗結(jié)果表明：移植的ICCs可在糖尿病小鼠體內(nèi)特殊環(huán)境下進一步分化生成更多類β細胞，合成和分泌適量胰島素，能顯著降低血糖水平。但在正常小鼠中能多向分化、異常增殖。第47頁/共54頁48討論

1,糖尿病小鼠體內(nèi)微環(huán)境對ICCs的定向誘導(dǎo)分化作用，可能使糖尿病的干細胞治療成為可能。

在體內(nèi)誘導(dǎo)較體外徹底，β細胞比例高于體外，能顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，說明糖尿病小鼠體內(nèi)特殊環(huán)境有利于ICCs向β細胞分化。（1）糖尿病小鼠的血清可作為胰腺干細胞體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)因子，其中高濃度葡萄糖和胰高血糖素樣肽1(GLP-1)起主要作用。（2）移植部位血管增生，為生長和分化提供營養(yǎng)並有利于胰島