細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)習(xí)題

載稱解釋細(xì)胞培養(yǎng)(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指將動(dòng)物活體體內(nèi)取出的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單細(xì)胞在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使其生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)與功能的方組織培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出活的組織(多只組織塊)在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。有時(shí)泛指所有的體外培養(yǎng)。器官培養(yǎng)：是將活體內(nèi)的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。無(wú)血清培養(yǎng)基：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子(生長(zhǎng)因子和激素、結(jié)合蛋白等)組成。體外培養(yǎng)的細(xì)胞在貼附底物上連接成片、相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。去分化(脫分化)：細(xì)胞在體外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全喪失！在適當(dāng)調(diào)節(jié)表現(xiàn)出分化特性。但分化能力會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸喪失。：各種分化細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)逐漸失去各自的形態(tài)與功能特征，表現(xiàn)出某種趨同性。原因：培養(yǎng)條件分化發(fā)生阻抑細(xì)胞分裂指數(shù)(MI)：是指細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)量原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱1)體外培養(yǎng)細(xì)胞，其生長(zhǎng)方式主要有貼壁生長(zhǎng)和懸浮生長(zhǎng)兩種，分別稱為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。2)一般可將貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的體外培養(yǎng)細(xì)胞大體分為成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型、多行細(xì)胞型四種3)體外培養(yǎng)細(xì)胞的主要生長(zhǎng)特點(diǎn)：①貼附生長(zhǎng)②接觸抑制③密度依賴性培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化：①去分化(脫分化)②不適應(yīng)要求：1)培養(yǎng)前準(zhǔn)備2)操作間消毒3)洗手和著裝4)火焰消毒用液的類型、配制和無(wú)菌處理方法：1)操作程序規(guī)范2)試劑設(shè)備專人負(fù)責(zé)3)培養(yǎng)用品定點(diǎn)存放2、平衡鹽溶液(BBS)：(1)成分：無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖，少量酚紅。(2)作用：維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿酶消化液主要作用是水解細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞相互分離。要作用是通過(guò)結(jié)合(螯合)細(xì)胞間質(zhì)中的二價(jià)陽(yáng)離子從而破壞細(xì)胞之間的細(xì)胞連接。達(dá)到分散細(xì)胞的目的。載液：膠原酶是從細(xì)胞中提取的一種酶，對(duì)膠原組織和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，而對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞一般2)合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的，配方恒定的培養(yǎng)基。3)完全培養(yǎng)基;定義：在合成培養(yǎng)基里添加血清后的培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基:常用培養(yǎng)基，血清含量高,10-4)無(wú)血清培養(yǎng)基：定義：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子(生長(zhǎng)因子和激素、結(jié)合蛋白等)組成。合成培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)的成分只能維持細(xì)胞生存素：防止污染不同?？煞譃闈摲凇⒅笖?shù)生長(zhǎng)期、停滯期(平頂期)1.潛伏期特點(diǎn)：1)細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的恢復(fù)期(包括懸浮期、貼壁期、潛伏期三個(gè)時(shí)期)2)可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基細(xì)胞分裂指數(shù)和細(xì)胞群體倍增時(shí)間表示。6、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)具有一系列優(yōu)點(diǎn)：刪胞培養(yǎng)技術(shù)研究細(xì)胞的生命活動(dòng)規(guī)律，可以很方便地采用各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法來(lái)、檢測(cè)和記錄。極其廣泛。好的細(xì)胞群，降低實(shí)驗(yàn)成本。載2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)：③體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞存在或多或少的差異。(形態(tài)和功能的差異)理想的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室可分為：準(zhǔn)備室、緩沖室(與培養(yǎng)室相連的消毒房間，作為隔離培養(yǎng)室與外面非消毒房間的緩沖地帶)、培養(yǎng)室(一間或幾間)，普通實(shí)驗(yàn)室、辦公室。培養(yǎng)細(xì)胞生命期：指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。包括三個(gè)階段：原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期、衰退期。1.原代培養(yǎng)期(也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周)2.傳代培養(yǎng)期(定義：原代細(xì)胞接種到兩個(gè)或以上的器皿繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)標(biāo)志進(jìn)入傳代培養(yǎng)期)亡。驟 (2)在遺傳學(xué)上的應(yīng)用染色體分析，雜交育種。 (3)在胚胎學(xué)上的應(yīng)用通過(guò)體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞，進(jìn)行體外受精、胚胎分割和移植。 (4)在病毒學(xué)上的應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞為病毒的增殖提供場(chǎng)所。 (5)在藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用藥品、食品添加劑等對(duì)機(jī)體的毒性及其產(chǎn)生不良影響的安全性調(diào)查。(許多致畸、胞會(huì)發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異。) (1)用于遺傳疾病和先天畸型的產(chǎn)前診斷用羊膜穿刺技術(shù)獲得胎兒細(xì)胞，培養(yǎng)后進(jìn)行染色體分析，診斷胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型。 (2)用于癌癥的早期診斷和預(yù)防通過(guò)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，對(duì)其染色體進(jìn)行對(duì)比分析檢測(cè)出易患癌癥的病人，進(jìn)及早的預(yù)防和治療。 (3)用于臨床治療目前已有將正常骨髓細(xì)胞經(jīng)大量培養(yǎng)后植入患造血障礙癥患者體內(nèi)進(jìn)行治療的報(bào)道。 新品種的培育可大大縮短育種進(jìn)程，且更加經(jīng)濟(jì)有效。胚胎干細(xì)胞的研究成果和克隆羊多莉的4.在生物制品生產(chǎn)上的應(yīng)用細(xì)胞可生產(chǎn)的生物制品有各類疫苗、干擾素、激素、酶、生長(zhǎng)因子、病毒殺蟲(chóng)劑、單克隆抗體等。載染。牛血清和小牛血清，它們的區(qū)別清是從母牛剖腹取出的胎牛中分離出來(lái)的血清，對(duì)許多細(xì)胞系均有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，主要用于細(xì)胞株的保化法傳代步驟 (1)吸出或倒掉瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液。 (5)計(jì)數(shù)，接種到新的培養(yǎng)瓶。采用離心法傳代細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心5min,然后取出上清，加入新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，1)培養(yǎng)液觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。pH2)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況倒置顯微鏡觀察。4、微生物污染：培養(yǎng)液渾濁、漂浮菌絲。長(zhǎng)減緩、胞質(zhì)顆粒增多、培養(yǎng)液不變混?！叭シ只辈豢赡?染色體變化)?！安贿m應(yīng)”可重新誘導(dǎo)(培養(yǎng)條件變化)載去分化需要注意：①去分化并不意味著完全返回胚胎時(shí)期的原始細(xì)胞狀態(tài)。如:高度分化的神經(jīng)細(xì)胞和心肌經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù)，但已經(jīng)具備的生物電活動(dòng)特性不會(huì)完全失去。作用：在細(xì)胞代謝中有重要作用，是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需氨基酸，(在缺少時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良死亡)。二章細(xì)胞凍存的原則：慢凍快融2)加冷凍保護(hù)劑(常用：甘油或二甲基亞砜(DMSO))冷凍保護(hù)劑作用機(jī)理：1)冷凍保護(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成；易受損的-5~0度，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即①將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至37~40℃。②從液氮中取出凍存小管，立即投入37~40℃溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解。要在1~2min內(nèi)完成、細(xì)胞活性檢查、苯胺黑等。2.四唑鹽(MTT)比色法：活細(xì)胞可沉淀四唑鹽并形成藍(lán)紫色結(jié)晶，再用DMSO溶解結(jié)晶物，溶液顏色的深淺三章：組織塊培養(yǎng)是即將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的方法。基本方法：將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶載。離法消化細(xì)胞、鏡檢；②發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，終止消化，篩網(wǎng)過(guò)濾，大塊繼材的基本要求 (3)及時(shí)培養(yǎng)：可培養(yǎng)液4℃暫存。 (5)營(yíng)養(yǎng)豐富：添加10%血清。 (6)采用易培養(yǎng)組織：組織類型、分化程度、年齡等。 (7)作好記錄：來(lái)源等信息及標(biāo)本要保留。2)組織材料的分離方法可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。。有的優(yōu)點(diǎn)1，可以免受機(jī)體內(nèi)部因素的影響，從而便于研究理化和生物等因素對(duì)腫瘤細(xì)胞生命的影響2、便與研究腫瘤細(xì)4、可用抗癌藥物的快速篩選瘤性。四章培養(yǎng)技術(shù)：指在人工條件下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品微載體：微載體指直徑在60~250微米，能適用于細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的微珠，一般由葡聚糖或各種合成聚合物組成。模培養(yǎng)方法微囊化培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)以及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊， (一)貼壁培養(yǎng)載 (二)固定化培養(yǎng)于貼壁依賴性細(xì)胞，又適用于非貼壁依賴性細(xì)胞的包埋培養(yǎng)，細(xì)胞密度高，抗剪切力和抗污染力法：吸附法、包埋法、微囊法 (三)懸浮培養(yǎng)①微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性，適用細(xì)胞附著、伸展和增殖；收獲；④粒徑在60~250μm(溶脹后)之間，均一，差異不大于20μm。有利于細(xì)胞均勻分布在各微載體表面；120℃高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌；①培養(yǎng)初期階段；②粘附貼壁階段；③維持培養(yǎng)階段；④細(xì)胞收獲階段；階段模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用載1)溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作2)所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害3)膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)4)膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中的攪拌。介紹的幾種生物反應(yīng)器各自優(yōu)缺點(diǎn)①能提供充足氧氣；②良好的傳質(zhì)傳熱及密閉性能；③制備材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒；④有自動(dòng)檢測(cè)調(diào)控系統(tǒng)；高，3、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)1)培養(yǎng)器體積小，細(xì)胞高細(xì)胞損害?。?)濃縮產(chǎn)品；3)易于分離產(chǎn)物，不易清洗維護(hù)，價(jià)格高五章起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)，叫做抗原決定簇。B。理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和質(zhì)量控制位改變時(shí)，單抗不能發(fā)揮其作用應(yīng)用：1)用于疾病的診斷和治療：2)作為載體制備導(dǎo)向藥物。幾個(gè)問(wèn)題是什么1)細(xì)胞比例2)反應(yīng)時(shí)間3)反應(yīng)溫度4)PEG的選擇交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的基本原理1)要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng)。載 2)而骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞融合，得到雜種骨髓瘤 3)雜種細(xì)胞既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來(lái)徑合成DNA。這時(shí)正常細(xì)胞可以通過(guò)“補(bǔ)救合成途徑”,由胸腺嘧啶激酶(HK)和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT)利用T和H合成核酸而繁殖。6、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)原理第六章外植體：用于植物組織(細(xì)胞)培養(yǎng)的器官或組織(的切段)。離的懸浮細(xì)胞(單個(gè)細(xì)胞)，通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來(lái)獲得大量細(xì)胞群體的方法。。載2、外植體的預(yù)處理： (3)深層滅菌：氯化汞、次氯酸鈉等。 4.從愈傷組織分離得到細(xì)胞。素濃度很重要配合一定濃度的細(xì)胞分裂素；添加附加物。