蛋白組學在腎臟病研究中的應(yīng)用

蛋白組學在腎臟病研究中的應(yīng)用上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院腎臟科王偉銘精選課件前言腎臟病的治療進展緩慢細微的組織病理學：早期診斷、預(yù)后追蹤以及療效觀察尿液：與泌尿系統(tǒng)之間存在著天然的聯(lián)系，使得尿液在反映泌尿系統(tǒng)功能方面具有“地理”優(yōu)勢體外的腎活檢精選課件蛋白組學與腎臟PubMed：關(guān)鍵詞：‘proteomics’or‘proteome’or‘proteomic’togetherwith‘kidney’or‘renal’or‘urine’or‘urinary’2010.11.1：過去5年>1156篇解決臨床及基礎(chǔ)問題的途徑精選課件內(nèi)容蛋白組學技術(shù)蛋白組學與腎臟病研究精選課件蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組（proteome）：細胞、組織或機體在特定的時間和環(huán)境中基因組所動態(tài)表達的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學（Proteomics）：以蛋白質(zhì)組為研究對象，在蛋白質(zhì)水平上定量、動態(tài)、整體地研究生物體，并在此基礎(chǔ)上對疾病發(fā)病機理、預(yù)后判斷等方面進行探索從整體的角度,分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律的一個新的研究領(lǐng)域精選課件Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.精選課件NephrolDialTransplant(2010)25:11–16精選課件研究過程：蛋白質(zhì)分離、鑒定以及信息資料分析處理三部分精選課件蛋白質(zhì)組學重要工具1.蛋白質(zhì)的分析分離技術(shù)。2D-SDS：應(yīng)用最為廣泛1D-SDS高效液相層析（HPLC）等電聚焦（IEF）毛細管電泳（CE）離子交換液相層析（LC）反向（RP）-HPLC串聯(lián)。精選課件Two-dimensionalGelElectrophoresisCutoutSpotsandIdentifyProteinsbyTandomMassSpectroscopy精選課件2.質(zhì)譜（MS）技術(shù)：蛋白質(zhì)肽的精確質(zhì)量測定對肽序列進行分析精選課件質(zhì)譜技術(shù)Massspectrometry-basedproteomictechnologies基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI-MS):利用基質(zhì)吸收激光的能量使得固相的多肽樣品離子化電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS):在噴射過程中利用電場完成多肽樣品的離子化精選課件表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（surfaceenhancedlaserdesorptionionizationtime-offlightmassspectrometry，SELDI-TOF-MS）通過測量肽段離子相關(guān)參數(shù),如飛行時間(TOF),即可計算得到準確的肽段質(zhì)量質(zhì)譜技術(shù)精選課件FourdifferenttypesofMS-basedproteomictechnologies

(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)CE-MS精選課件FourdifferenttypesofMS-basedproteomictechnologies

(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)CE-MS精選課件

不同蛋白質(zhì)組學技術(shù)的比較技術(shù)

優(yōu)勢局限性2DE-MS適合大分子，通過二維斑點可估計實際分子量并進行排序無法檢測分子量<10kD的多肽，無法自動化，耗時，可比性差SELDI-MS高通量，自動化，操作簡便，需樣本量小局限于所選擇蛋白質(zhì)，分辨率差，可比性差，對干擾物敏感LC-MS自動化，敏感度高，多維度，可檢測大分子生物標記物（>20kD）耗時，敏感度與成分有關(guān)，檢測物分子量范圍有限CE-MS自動化，敏感度高，省時，樣本量小，多維度不適合于大分子（>20kD）精選課件多維液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)

通過相對和絕對定量的同位素標簽試劑（iTRAQ）,還可以用質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)的定量分析。ICAT技術(shù)是指采用同位素標記多肽或蛋白質(zhì)的親和標簽技術(shù)(isotopecodedaffinitytags,ICAT)

可以較準確的鑒定出不同狀態(tài)細胞或組織中差異表達的蛋白質(zhì)

質(zhì)譜技術(shù)還可以用于鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物組成、確定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的類型與發(fā)生位點等精選課件新技術(shù)AgilentHPLC-ChipII，是高通量、微型化和自動化為特點的蛋白組學檢測技術(shù)。能同時從微量的樣品中檢測多種蛋白質(zhì)或多肽，用于分析差異表達的蛋白質(zhì)及藥物靶標的鑒定。精選課件數(shù)據(jù)分析datamining蛋白質(zhì)組研究中的生物信息學蛋白質(zhì)氨基酸序列(sequence)數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與家族數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及分類數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)2DE圖譜數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫精選課件內(nèi)容蛋白組學技術(shù)蛋白組學與腎臟病研究精選課件精選課件尿蛋白質(zhì)組Davis和Spahr（2001）：尿蛋白質(zhì)組研究的早期開拓者用LC-MS/MS方法分析了酶切后的混合尿樣，共鑒定出124個蛋白。Thongboonkerd（2002）：第一張人尿蛋白質(zhì)組2D圖67種蛋白及它們的異型體蛋白大部分是尿液中的高豐度蛋白由病變組織漏出、分泌、裂解而釋放出的生物標志物很多都是低豐度蛋白精選課件尿液標本的準備標本收集:空腹晨尿或中段尿標本處理：蛋白測定乙醇沉淀ethanolprecipitation

真空濃縮vacuumcentrifugation

微濃縮microconcentration

反相捕獲柱reversephasetrappingcolumn標本儲存：?70℃或?20℃精選課件穩(wěn)定性/差異性尿蛋白質(zhì)組在個體間存在著明顯的差異由于鍛煉、飲食、生理節(jié)奏等因素的影響，同一個體不同時間段的尿蛋白質(zhì)組也會發(fā)生改變尿蛋白組隨時間發(fā)生變化，晨尿較其他時間點包含更多蛋白點不同天內(nèi)所得尿蛋白組間較同一天內(nèi)不同時間點間差異更大精選課件穩(wěn)定性/差異性個體間較個體內(nèi)存在更明顯的差異早期小樣本試驗得到的候選標志物必須經(jīng)過大樣本的驗證，才能確定哪些蛋白的變化真正是由疾病導(dǎo)致的，而并非生物學上的變異造成的精選課件糖尿病腎病Belleietal.(2008)方法：2DE和ESI-Q-TOFMS/MS2型糖尿病早期腎臟改變：尿液生物標記物正常白蛋白尿(n=10)、2型糖尿病腎病(n=12)、健康對照(n=12).11種差異表達蛋白3種蛋白減少：前列腺酸性磷酸酶前體（prostaticacidphosphataseprecursor）,核酸核酶,激肽釋放酶-38種蛋白進行性增加：transthyretinprecursor,免疫球蛋白κ(Igκ)C鏈region,IgκV鏈-IIregionCum,Igκ-V鏈-IIIregionSIE,碳酸酐酶1,血漿視黃醇結(jié)合蛋白,β2-微球蛋白前體,β2-糖蛋白1.ProteomicsClin.Appl.,2(4):478-491.精選課件糖尿病腎病Lapollaetal.(2009)方法：MALDI-MS病例：糖尿病、腎病、糖尿病腎病、健康對照差異蛋白：1219,1912,和2049DaMALDI-TOF/TOF：uromodulin,I型膠原α1前體,和IV型膠原α-5鏈前體J.MassSpectrom.,44(3):419-425.精選課件糖尿病腎病WuJ,ChenYD,GuW（2008）方法：SELDI-TOF-MS病例：106例正常、微量、大量白蛋白尿DM、50例健康對照差異蛋白：4239.0,4453.5,5281.1,5898.5Da特異性：80%；敏感性：75%.Wuetal./JZhejiangUniv-SciB(Biomed&Biotechnol)201011(4):227-237精選課件糖尿病腎病Jiangetal.(2009a)方法：2DE和MALDI-TOF/MS病例：2型糖尿病正常白蛋白尿、微量白蛋白尿、大量白蛋白尿和健康對照差異蛋白：12種蛋白E-cadherin增加1.3-,5.2-,8.5倍Westernblot：尿標本中表達增加ELISA：sE-cadherin/肌酐比顯著增高(DN)免疫組化：腎小管上皮細胞E-cadherin表達減少(DN)E-cadherin可作為糖尿病腎病相關(guān)的新的標志物DiabetesMetabResRev2009;25:232–241.精選課件糖尿病腎病Jiangetal.,2009b

方法：2DE和MALDI-TOF-MS目的：監(jiān)測糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展病例：12例DN(1型和2型糖尿病)、6健康對照差異蛋白：orosomucoid驗證：90例糖尿病患者、30例健康對照尿orosomucoid排泄率(UOER)隨白蛋白尿進行性上升尿orosomucoid可作為DN的生物標志物NEPHROLOGY2009;14,332–337精選課件2-Dgelelectrophoresis(2-DE)imagesofurinesamplesfromdiabeticnephropathy(DN)patientsandhealthycontrols.NEPHROLOGY2009;14,332–337精選課件IgA腎病Haubitzetal.(2005)方法：CE-MS差異：正常對照（57例）IgAN特異性尿多肽譜IgAN（45例）：敏感性100%、特異性90%膜性腎病（13例）：敏感性77%、特異性100%3種多肽masses：2752.4,2427.1,2057.3Da血清白蛋白片段KidneyInt.,67(6):2313-2320.精選課件IgA腎病Rocchettietal.(2008)方法：2DE和nano-HPLC-ESI-MS/MS病例：正常對照20例、IgANR(ACEI)9例、IgANNR9例差異蛋白:激肽原,inter-α-trypsininhibitorheavychainH4precursor(ITIH4),甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白(transthyretin)驗證：IgANR和IgANNR之間尿差異蛋白顯著不同免疫雜交：低水平的尿激肽原提示IgAN對ACEI治療反應(yīng)差的預(yù)測指標Proteomics,8(1):206-216.精選課件腎小球腎炎Mischak（2004-2005）方法：CE-MS-生物信息的方法構(gòu)建一個尿液（和其他體液）蛋白質(zhì)組診斷模型用于各種可以進展為腎衰的小球疾病的診斷和鑒別診斷。MCD(16)、MN(18)、FSGS(10)與正常尿液(57)KidneyInt,2004,65(6):2426-34KidneyInt,2005,67(6):2313-20MassSpectromRev.2009;28(5):703–724.精選課件腎小球腎炎正常組多肽模式：173個在90%以上正常人尿液中出現(xiàn)的多肽，690個在50%以上正常人尿液中出現(xiàn)的多肽，疾病分別構(gòu)建了含500個以上多肽模式對疾病分類的準確性：MCD/FSGS71.4%，MN92.9%。KidneyInt,2004,65(6):2426-34KidneyInt,2005,67(6):2313-20MassSpectromRev.2009;28(5):703–724.

精選課件狼瘡性腎炎Mosleyetal.(2006)SELDI-TOFMS差異蛋白：m/z3340和3980Da活動和非活動LN：敏感性和特異性均92%預(yù)測LN的復(fù)發(fā)與緩解未作進一步鑒定active(n=26)andinactive(n=49)lupusnephritispatientsROCcurveforthetwobiomarkerswasgeneratedusinglogisticregressionscores,withanareaunderthecurveof0.967.

精選課件狼瘡性腎炎Suzukietal.(2009)SLE或青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎：8種生物標記物m/zof2.7,22,23,44,56,79,100,133kDa（LN）鑒定：23-kDa：脂質(zhì)運載蛋白型前列腺素-D合成酶(L-PGDS),56-kDa：α1酸性糖蛋白(AGP)or類粘蛋白(orosomucoid,ORM)79-kDa：轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf),133-kDa：銅藍蛋白(Cp)其它：白蛋白或白蛋白片段這些蛋白可能可作為預(yù)測LN病程PediatrRes.2009May;65(5):530-6.

精選課件狼瘡性腎炎Zhangetal.(2008)方法：SELDI-TOF-MS選擇27/176種差異表達蛋白（不同活動期）

3中低分子生物標記物Hepcidin的20、25氨基酸異構(gòu)體α1-antitrypsin片段白蛋白肝性殺菌肽(hepcidin)：與LN促炎癥細胞因子有顯著相關(guān)意義KidneyInternational74,799–807(2008)

精選課件UrineSELDIspectraofclassIVSLEnephritisflare

cycles.(a)Thespectraofawholeflarecyclearepresented

betweenthe2000and10,000Daregion.TheLMWurine

proteomeshowsanoverallincreaseinpeaksbetween2000and

4000Daasflareapproaches,whichthendecreaseduringflare

treatment.(b)Thespectrafrom4monthspre-flareandflareofaclassIVGNpatientshowingthatsomeproteinionsdecreaseattheflare.精選課件Intrarenalexpressionofhepcidin.Immunohistochemicalstainingforhepcidinisshownforrenalbiopsymaterialfromanormalkidney(CONT),andthreepatientswithclassIVSLEnephritis(SLE).Thepositivecellsareinfiltratinginterstitialleukocytes.精選課件甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)

與造影劑引起的急性腎損傷(CIN)有關(guān)凝集素途徑可能參與造影劑致腎損傷MBL:CIN可能的生物標記物

造影劑腎損傷精選課件ARFExosomalfetuin-A:biomarkerofAKI大鼠ARF模型患者Westernblots證實ischemicARF:血漿譜:NGAL、cystatinC尿譜:NGAL,IL-18,KIM-1,cystatinC,a1-MG,fetuin-A,Gro-alpha,meprin.評價ARF的持續(xù)時間和嚴重性預(yù)測疾病的進展和不良臨床預(yù)后有助于區(qū)分ARF的不同病因?qū)WKidneyInt.2006;70:1847–1857.CurrOpinNephrolHypertens.2008;17:127–132精選課件腎臟纖維化機制研究

PhosphoproteomicStudyofHumanTubularEpithelialCellinResponsetoTransformingGrowthFactorβ-1-InducedEpithelial-to-MesenchymalTransition

Yong-XiChen,YaLi,Wei-MingWang,WenZhang,Xiao-NongChen,Yin-YinXie,NanChen

AmJNephrol2010;31:24–35利用同位素標簽技術(shù)（iTRAQ）對TGF-β誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞損傷過程中磷酸化蛋白的蛋白質(zhì)組學研究精選課件

結(jié)果：TGF-β可致腎小管上皮細胞損傷轉(zhuǎn)分化-形態(tài)學改變轉(zhuǎn)分化-形態(tài)學改變促凋亡-流式促凋亡-流式TGF-b1致腎小管上皮細胞損傷轉(zhuǎn)分化-Real-timePCR轉(zhuǎn)分化-Westernblot精選課件結(jié)果：磷酸化蛋白富集123123123332112精選課件結(jié)果：iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS/MS分析本次質(zhì)譜鑒定檢測到2