免疫親和純化和免疫沉淀

免疫親和純化和免疫沉淀第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控及記憶、識(shí)別等多種生理功能。第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物之中分離純化出所需要得到的目的蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)研究當(dāng)中的核心技術(shù)。該技術(shù)難度和成本均高；例如一個(gè)生物藥品的成本75%都花在下游蛋白質(zhì)分離純化當(dāng)中。

第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三生物工程上游技術(shù):是理論的研究,技術(shù)的開發(fā)等,如：基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究等。生物工程下游技術(shù)：一般包括產(chǎn)物（一般為蛋白質(zhì)）的預(yù)處理及分離純化；產(chǎn)品的成型加工和質(zhì)量監(jiān)控等一系列單元操作和過程中的主要技術(shù),其中生化產(chǎn)物及發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化是其核心內(nèi)容。下游技術(shù)是生物工程重要組成部分,是生物高科技技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，如：酶工程,發(fā)酵工程等（提取干擾素、胰島素和酶等）。

第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)分離純化的意義①從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶等。第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三蛋白純化策略

分離蛋白質(zhì)常用的純化方法有超速離心和梯度密度離心法、鹽析法、電泳、凝膠過濾（分子篩）、離子交換層析、親和層析以及高效液相色譜等方法……。親和沉析技術(shù)是純化各種生物大分子最有效的方法之一。

第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三超速離心

是分離亞細(xì)胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手段，往往是進(jìn)一步純化的第一次過篩。超速離心又分差速離心和梯度離心。用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據(jù)蛋白的比重特點(diǎn)分離的方法，除個(gè)別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原蛋白如載脂蛋白A、B等。對于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。

第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

鹽析沉淀法

是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離技術(shù)。由于方法簡便、有效、不損害蛋白抗原活性等優(yōu)點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用。

鹽析法原理第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三鹽析沉淀法的原理

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是親水性大分子，所以在水溶液中有雙電層結(jié)構(gòu)的水合膜，來保證分子的溶解度平衡并穩(wěn)定存在。當(dāng)加入鹽時(shí)，鹽會(huì)電離成離子態(tài)，離子的電性破壞了蛋白質(zhì)的雙電層的水合膜結(jié)構(gòu)，從而使其沉降，析出。

加入濃酸和濃堿是不行的，苛性的環(huán)境將使蛋白質(zhì)變性。

第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

凝膠過濾和離子交換層析

凝膠過濾又稱凝膠柱層析、分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。離子交換層析是利用一些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附帶相反電荷的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應(yīng)用或者反復(fù)應(yīng)用其中的一種，皆可將某一蛋白質(zhì)從一復(fù)雜的組分中純化出來。

第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三凝膠過濾(分子篩層析)圖示1第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三凝膠過濾(分子篩層析)圖示2

第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

離子交換層析柱第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

親和層析

是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。例如抗原和抗體（免疫親和層析）、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合物。如果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體或共價(jià)結(jié)合在一種惰性的微珠上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點(diǎn)是迅速，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化的目的。

第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

免疫親和純化技術(shù)

親和純化(affinitypurification)是基于目標(biāo)分子與固定化配體的特異性相互作用(如：抗原-抗體)。親和技術(shù)可用來從混和物中分離特定分子。捕獲目標(biāo)分子用于相互作用研究,或從反應(yīng)體系中去除某一成分。第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫親和純化原理第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫親和純化是一種分離各種生物大分子最有效的方法特點(diǎn)：

1、高純化率，通常為常規(guī)純化的1,000-10,000倍以上。2、由于內(nèi)在的背景限制，如目標(biāo)抗原量非常稀少，需與其他方法結(jié)合才能獲得均質(zhì)性產(chǎn)物。3、快速純化抗原，層析柱?？芍貜?fù)使用?？砂凑詹煌?guī)模進(jìn)行，半天內(nèi)即可完成。4、不僅適用于純化抗原，也可用來分離經(jīng)過初步純化的抗體，乃至所有能與相應(yīng)配體有效結(jié)合的生物分子。5、抗體與其相應(yīng)抗原結(jié)合具有高度親和力和特異性，能大量分離天然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原。6、需要適當(dāng)純化的抗體，不是所有的抗體都適用于免疫親和層析，但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就簡單、快速、可靠。7、不能用于定量測定。

第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫親和純化技術(shù)發(fā)展歷史：最早是將抗體作為一種結(jié)合劑用于免疫親和純化，根據(jù)其自身交聯(lián)產(chǎn)生大量多聚體和不溶性基質(zhì)原理收集抗原。隨后利用抗體與惰性微珠共價(jià)結(jié)合，雖然這是一種簡單的結(jié)合，但抗體的許多反應(yīng)性因缺乏定位作用或抗體的過量結(jié)合而喪失。通過研究發(fā)現(xiàn)，抗體與蛋白A和蛋白G微珠共價(jià)連接后更容易與抗原結(jié)合。將具有良好抗原結(jié)合特性且來源廣泛的各種單克隆抗體制成免疫親和層析柱，已成為一種最適用和有效的純化方法。親和層析技術(shù)最先是由Cuatrecasas等人建立（1968年）。

BCX2003P2.PPT第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三影響免疫親和層析純化效果的因素

抗原初始相對濃度（即純度）：是決定最終產(chǎn)物純度極為重要的因素?？乖c抗體的親和力：是免疫親和純化層析過程中最麻煩的問題。高親和力抗體（>10-8mol/L)能在1h以內(nèi)達(dá)到有效的分離，而低親和力的抗體(﹤10-6mol/L）即使在高濃度時(shí)也不能結(jié)合溶液中的全部抗原。使用針對同一抗原多個(gè)表位的多克隆抗體以增強(qiáng)親和力的方法固然可結(jié)合較多的抗原，但增加了洗脫的困難性。只有當(dāng)所需的最終產(chǎn)物為變性蛋白時(shí)，才選用識(shí)別多個(gè)表位的抗體。第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫親和純化的關(guān)鍵：高親和力與容易洗脫的優(yōu)化組合。常見錯(cuò)誤是將低親和力和容易洗脫等同看待。第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三1．親和層析支持物的選擇:作為親和層析支持物須符合以下要求：①非特異性吸附低；②液體通過時(shí)流速要快；③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；④必須有合適的、豐富的化學(xué)基團(tuán)，能有效地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；⑤必須帶有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。符合以上5個(gè)條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。

第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三2．配體的選擇:所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個(gè)條件。（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。（2）抗原與抗體之間必須有強(qiáng)的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質(zhì)和數(shù)量。對抗體來說還決定于抗體來源動(dòng)物的種類和免疫時(shí)間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時(shí)間短的親和力低。但是，親和力太強(qiáng)也不利，因?yàn)榻怆x抗原抗體復(fù)合物所需要的條件就要強(qiáng)烈，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低pH（1.5～2.5）或高鹽（如6mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。（3）配體必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)：這個(gè)基團(tuán)不參與配體和大分子的特異結(jié)合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應(yīng)當(dāng)影響配體與大分子結(jié)合的親和性。第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

3．抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法4類。第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團(tuán)，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團(tuán)上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質(zhì)。第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時(shí)進(jìn)行處理，則能使支持物活化。此時(shí)溴化氰與支持物上的羥式反應(yīng)形成氨基甲酸酯基團(tuán)。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時(shí)首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應(yīng)混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應(yīng)是親和分離濃度的20～30倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應(yīng)減少。交聯(lián)時(shí)的pH也應(yīng)注意，pH9.5～10時(shí)，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低pH，也就減少了能反應(yīng)的配體濃度，交聯(lián)量就會(huì)減少。第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，產(chǎn)生了所謂的無效吸附。另外，Sepharose4B交聯(lián)時(shí)要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)。基于這兩個(gè)原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長度的“手臂”。必要時(shí)這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應(yīng)，使用極為方便。第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

親和純化的多克隆抗體單克隆抗體信號(hào)強(qiáng)度(抗體結(jié)合容量）非常好視抗體而異，但應(yīng)該非常好特異性非常好非常好優(yōu)點(diǎn)洗脫峰形易分辨（已知），應(yīng)用不受限制，特異性強(qiáng)

特異性強(qiáng)缺點(diǎn)制備困難，應(yīng)用受限需要篩選合適的抗體

注：不推薦將未經(jīng)純化的多克隆抗體或混合的單克隆抗體用于免疫親和純化。

第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫親和純化層析的基本操作步驟：交聯(lián)→結(jié)合→洗脫1、將抗體與基質(zhì)（微珠）共價(jià)交聯(lián)并制備抗體親和層析柱。2、將抗原結(jié)合到抗體-基質(zhì)微珠上。3、抗原的洗脫。第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三親和層析條件的選擇：

（1）支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)，為了封閉這些殘基團(tuán)，必須用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團(tuán)。（2）去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脫2～3個(gè)柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。（3）解脫劑有多種：常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液。第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三抗體親和層析柱的制備：抗體與固相基質(zhì)的連接：1、最常用的基質(zhì)為蛋白A和蛋白G微珠，可與抗體的Fc功能區(qū)特異結(jié)合。2、將抗體直接與一種活性微珠（表達(dá)活性的反應(yīng)基團(tuán)）連接。

第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三抗體與微珠的結(jié)合方法試劑優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)與抗體結(jié)合的基團(tuán)蛋白A抗體定向確切，粒柱還能與其他無關(guān)二甲基庚二酸酯-NH2

容易結(jié)合的抗體結(jié)合，昂貴蛋白G抗體定向確切，粒柱還能與其他無關(guān)二甲基庚二酸酯-NH2

容易結(jié)合的抗體結(jié)合，昂貴活性微珠價(jià)廉，不結(jié)合抗體無定向性，且常羰基二咪唑-NH2

其他無關(guān)抗體因過量結(jié)合而損傷溴化氰-NH2

羥基丁二酰亞胺-NH2碘乙?；?NH2

氯化tresyl-NH2,-SH第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三從免疫親和層析柱上洗脫抗原：理想的洗脫峰形為一清晰的尖峰，用單一的緩沖液處理后可使抗原完全釋放。探索最佳的洗脫條件是一項(xiàng)積累經(jīng)驗(yàn)的工作。有三種方法：1、用較強(qiáng)烈的條件處理;2、加入模擬結(jié)合位點(diǎn)的飽和量小分子化合物;3、使用一種能引起構(gòu)象改變而使抗原釋出的試劑。第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三洗滌液和洗脫液的選擇第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫沉淀技術(shù)是利用抗體與相應(yīng)抗原的高親和力特性作為檢出和結(jié)合溶液中靶分子的方法，通過將抗原聚集在惰性微珠上，可以簡單快速的將抗原純化1000-10000倍。

免疫沉淀

(Immunoprecipitation)第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫沉淀的應(yīng)用：1、目標(biāo)抗原的純化。2、確定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。3、測定蛋白質(zhì)抗原半壽期。4、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的測定。5、研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。6、蛋白質(zhì)內(nèi)在或相關(guān)酶活性的測定。7、裂解物特定抗原的清除。第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫沉淀的特點(diǎn)：1、確定抗原的存在、質(zhì)量、大小、轉(zhuǎn)換、修飾及相關(guān)性；2、多個(gè)步驟共需1/2-1天；3、半定量到定量；4、敏感性取決于抗原的相對質(zhì)量及抗體的親和力；5、需要高親和力的抗體。第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫沉淀的主要影響因素：1、抗原原液的豐度2、抗體對抗原的親和力第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三

合適抗體的選擇

多克隆抗體單克隆抗體混合單克隆抗體反應(yīng)強(qiáng)度極好極差到極好極好特異性良好極好極好，存在交叉反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)穩(wěn)定，多價(jià)反應(yīng)特異，供應(yīng)不受限制兼?zhèn)淙秉c(diǎn)本底不易清除需對抗原有高親和力供應(yīng)不普遍第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三免疫沉淀步驟：一、抗原溶液的制備二、裂解物非特異性本底的預(yù)處理三、免疫復(fù)合物的形成與純化

/courses/genomics/IMPfolder/IMPQ.html第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三第54頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三一、抗原溶液的制備1、裂解細(xì)胞：

細(xì)胞裂解過程中有多種蛋白酶釋放，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解從而影響免疫沉淀，解決方法有兩種：低溫操作或加入蛋白酶抑制劑。第55頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三2、裂解液的選擇：裂解條件應(yīng)盡量溫和，以保護(hù)抗體結(jié)合位點(diǎn)及避免蛋白的溶解，但裂解條件又應(yīng)足夠劇烈，以保證抗原的定量釋放。對于去污劑的使用，非離子