酶工程(酶制劑制備)

酶工程(酶制劑制備)第一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日

——（細(xì)胞破碎）

——發(fā)酵液預(yù)處理

——酶液脫色

——酶蛋白的初步純化與濃縮

——（酶蛋白的提純與精制）

——酶制劑的成形。CH4.1酶制劑的工業(yè)提取方法第二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4.1酶制劑的工業(yè)提取方法

1細(xì)胞破碎方法對(duì)于胞內(nèi)酶的提取與制備，首先要把細(xì)胞破碎，使局限在細(xì)胞內(nèi)的酶蛋白游離出來(lái)，常用的破碎方法有以下幾種：

1.1機(jī)械破碎法：1.2物理破碎法：1.3化學(xué)方法：①機(jī)械搗碎法：10000轉(zhuǎn)/分。②研磨法：只適合于實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模操作。③勻漿法：細(xì)胞的破碎程度較高，規(guī)模小。①溫差破碎法：②超聲波（>20kHz）裂解法：15-25kHz，100-150W，0-10℃，3-10min；

目前有效的化學(xué)方法主要是加入表面活性劑法常用的有：特里頓X-100和吐溫（Tween），其主要是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增加膜通透性。此法在實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)上已成功應(yīng)用

第三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4.1酶制劑的工業(yè)提取方法

2發(fā)酵液的預(yù)處理2.1發(fā)酵液絮凝發(fā)酵液首先要進(jìn)行過(guò)濾除菌，在發(fā)酵液中，由菌體自溶產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、核酸、雜蛋白等大分子物質(zhì)，使得發(fā)酵液很難過(guò)濾；在過(guò)濾前必須進(jìn)行絮凝處理。

發(fā)酵液的預(yù)處理的常用方法主要是在發(fā)酵液中加入絮凝劑，常用的絮凝劑有：聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）磺化聚苯乙烯（PolystyreneSulfonate）；絮凝劑加入，主要有以下三方面的作用：①改變發(fā)酵液中懸浮粒子的物理特性，如加大粒子的大小，提高粒子的硬度等；②使一些可溶性的膠體物質(zhì)變成不溶性的沉淀粒子；③降低發(fā)酵液的黏度。

2.2酶液的脫色這一步驟可根據(jù)酶制劑的要求而定，一般工業(yè)酶制劑允許含有來(lái)源中的色素，所以就不脫色；對(duì)于醫(yī)用酶制劑、分析用酶等必須進(jìn)行脫色處理；目前大部分工業(yè)酶制劑都要進(jìn)行脫色處理過(guò)程。常用的脫色劑有活性炭和離子交換樹(shù)脂。活性炭吸附法，操作效率較高，脫色較徹底，但在脫色的同時(shí)，也有部分酶蛋白被吸附掉了；離子交換樹(shù)脂基本上在脫色的同時(shí)，不吸附酶蛋白。

我國(guó)生產(chǎn)了一種脫色專(zhuān)用樹(shù)脂：通用１號(hào)脫色樹(shù)脂。在弱酸性條件下，其吸附色素，而在堿性條件下便釋放色素。樹(shù)脂的再生方便，再生的條件是：先用５％的NaOH洗脫色素，待色素洗脫干凈后，用蒸餾水洗到中性，再用5%的HCl（二倍樹(shù)脂床體積）中和樹(shù)脂，再用蒸餾水洗到為止。第四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4.1酶制劑的工業(yè)提取方法

3酶蛋白的初步純化與濃縮

3.1鹽析法

[1]鹽析的基本原理：蛋白質(zhì)在水中的溶解度與其所帶凈電荷的多少呈正相關(guān)，即蛋白質(zhì)的極性越強(qiáng)，其溶解度越大，溶液中的離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分，從而減弱蛋白質(zhì)的水合程度，降低其溶解度；另一方面，液相中離子的電荷部分地中和蛋白質(zhì)分子上的電荷，使其凈電荷降低或凈電荷消失，促使蛋白質(zhì)析出；此外，溶液中的鹽離子引起水分子的極化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。

在鹽溶液里，蛋白質(zhì)的溶解度的對(duì)數(shù)值與溶液里的離子強(qiáng)度成線性關(guān)系，人們總結(jié)了以下經(jīng)驗(yàn)公式：

logS=β-Ks.μS:Protein的溶解度g/l；β為溶液離子強(qiáng)度為零時(shí)的logS，

β值受蛋白質(zhì)性質(zhì)、鹽離子的種類(lèi)、溶液的溫度和pH值的影響；

Ks為鹽析常數(shù)，因蛋白質(zhì)而性質(zhì)和鹽離子的種類(lèi)不同而不同；μ為溶液的離子強(qiáng)度。

[2]鹽析的基本方法：蛋白質(zhì)的鹽析方法主要有以下兩種：

Ks鹽析法：即蛋白質(zhì)溶液的pH值和溫度固定不變，改變?nèi)芤旱柠}濃度（離子強(qiáng)度），以達(dá)到沉淀蛋白的作用；此法常用的鹽是硫酸銨。

β鹽析法：是在一定的離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱膒H值和溫度，以達(dá)到蛋白沉淀的目的。在實(shí)際工作中，常用的是Ks鹽析法，利用不同飽和度的(NH4)2SO4濃度，這樣不同的蛋白質(zhì)析出沉淀的(NH4)2SO4

濃度不同；通過(guò)這種方法可將部分雜蛋白分離出去，達(dá)到濃縮酶蛋白的目的。[3]鹽析曲線：按鹽析經(jīng)驗(yàn)公式，以中性鹽濃度對(duì)酶蛋白溶解度作圖，得一條如下曲線：鹽濃度（飽和度）酶蛋白溶解度鹽溶效應(yīng)：[4]具體操作方法：飽和溶液法:干粉加入法:[5]影響鹽析的因素：

溫度：

pH：[6]鹽析后的脫鹽處理透析法：凝膠過(guò)濾法：第五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4.1酶制劑的工業(yè)提取方法

3酶蛋白的初步純化與濃縮3.2有機(jī)溶劑沉淀法

除用鹽析法沉淀酶蛋白外，還可以用有機(jī)溶劑沉淀酶蛋白，目前選用的有機(jī)溶劑主要有丙酮和乙醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的價(jià)格高，蒸餾回收困難，所以目前多采用乙醇作沉淀劑。

沉淀酶蛋白所需乙醇濃度受很多因素影響，溶液的離子強(qiáng)度、溫度、pH值等都影響蛋白質(zhì)的析出，低濃度的鹽離子有促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的作用，即所謂的鹽溶效應(yīng)；所以當(dāng)溶液中有低濃度鹽離子時(shí)，乙醇的濃度要增加；溫度升高蛋白質(zhì)的溶解度增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇濃度增加；pH值的影響因不同的蛋白質(zhì)而不同，一般情況下，當(dāng)溶液的pH值與酶蛋白的等電點(diǎn)一致時(shí)，需要的乙醇濃度最低，偏離酶蛋白的等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，酶蛋白所帶電荷越多，蛋白質(zhì)的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇濃度越高。一般作為沉淀劑的乙醇濃度是95%，沉淀不同的酶蛋白需要乙醇量稍有差異。如沉淀枯草桿菌的淀粉酶發(fā)酵液時(shí)，要求乙醇濃度為：每體積的發(fā)酵液加0.2—0.8體積的乙醇；當(dāng)沉淀蛋白酶時(shí)，加0.8—1.1體積的乙醇沉淀出的主要是中性蛋白酶，加1.1—1.4體積的乙醇時(shí)，沉淀出的主要是堿性蛋白酶。對(duì)于每一種酶蛋白的沉淀要求乙醇的適宜濃度需要實(shí)驗(yàn)確定。第六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4.1酶制劑的工業(yè)提取方法

3酶蛋白的初步純化與濃縮3.3

噴霧干燥法

此法是利用噴霧干燥技術(shù)，直接將液態(tài)酶濃縮成固體酶制劑，此法的生產(chǎn)效率較高，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，但此法在生產(chǎn)應(yīng)用上有一定的局限性，在噴霧干燥時(shí)，需要一定的溫度，在噴霧塔里面進(jìn)如一定溫度的熱空氣，對(duì)于那些對(duì)熱不穩(wěn)定的酶蛋白不宜使用，現(xiàn)用在生產(chǎn)的主要是生產(chǎn)α-淀粉酶。3.4膜分離技術(shù)除上述經(jīng)典的濃縮方法外，目前膜技術(shù)的發(fā)展已應(yīng)用到酶蛋白的濃縮和分離上來(lái)了，膜分離技術(shù)是以一定孔徑的高分子膜作為過(guò)濾介質(zhì)，將不同大小、不同性狀、物質(zhì)顆?；虼蠓肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。膜分離技術(shù)所使用的膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽璐玢、尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。在膜分離過(guò)程中，膜的作用是有選擇性地小于其孔徑的顆粒通過(guò)，將大的顆粒截留，根據(jù)欲分離的物質(zhì)顆粒的大小，選擇不同孔徑的膜。

根據(jù)物質(zhì)顆粒通過(guò)膜的原理及和推動(dòng)力的不同，膜分離技術(shù)可分為以下三種：①加壓膜分離加壓膜分離是以膜兩側(cè)的流體靜壓差為動(dòng)力，推動(dòng)小于膜孔徑的顆粒通過(guò)膜孔，大于孔徑的顆粒被截留。根據(jù)膜孔徑大小范圍又分為超濾、微濾和反滲透三種。

超濾：即超過(guò)濾，本技術(shù)過(guò)濾截留的顆粒直徑在20—2000A（0.2μm)相當(dāng)于分子量1000—5×105Da,并且有多種規(guī)格供選用。此法主要用于酶蛋白的濃縮和部分純化分離，此外，在生化藥業(yè)也常被采用。此技術(shù)采用的濾膜是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜，膜由兩層構(gòu)成，分表層和基層，表層是濾膜的有效層，其厚度為0.1—5μmμm，孔徑大小有多種規(guī)格，現(xiàn)有20—2000A的系列產(chǎn)品銷(xiāo)售；基層為支持層，主要負(fù)責(zé)膜的強(qiáng)度，其厚度為200—250μm具有堅(jiān)韌的強(qiáng)度。影響超濾的因素：膜的過(guò)濾效果用膜的流率來(lái)表示，即每平方厘米膜每分鐘濾過(guò)的流體量，以ml./cm2.min表示，影響流率的主要因素有膜孔徑的大小、顆粒性狀、溶液的黏度、流體靜壓。根據(jù)上述影響因素，可在一定范圍內(nèi)增加流體靜壓（一般控制在50—700kPa)、適當(dāng)提高溶液溫度、增加溶液的攪拌述度都可在一定程度上提高膜的流率。超濾技術(shù)在目前無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室研究還是酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用都非常廣泛，其操作簡(jiǎn)單，工作效率高，但對(duì)于那些有小分子輔酶的酶制劑不宜采用此技術(shù)。

微濾：又稱(chēng)微孔過(guò)濾，其孔徑較超濾膜的孔徑大，一般在0.2—2.0μm范圍，主要用于過(guò)濾去除細(xì)菌及其它顯微鏡下可見(jiàn)的顆粒物質(zhì)，此法在酶蛋白的濃縮和分離方面不用，主要勇于礦泉水、無(wú)菌水、軟飲料生產(chǎn)方面除菌和除去不溶性顆粒物質(zhì)。

反滲透：反滲透膜的孔徑最小，一般在20A，截留分子量為1000D主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)，此技術(shù)主要用于生產(chǎn)純水，海水的淡化等。

②電場(chǎng)膜分離：將膜分離裝置置于電場(chǎng)下，被分離的物質(zhì)在電場(chǎng)的作用下，借助電場(chǎng)力作為推動(dòng)力，以達(dá)到分離的目的。利用電場(chǎng)膜分離的物質(zhì)，必須具備一個(gè)基本條件，那就是其必須是帶電粒子，如果其不帶電荷，或其靜電荷為零，這樣的粒子就不適宜用此法分離。常用的有以下兩種方法：

電滲析：在一個(gè)電滲槽內(nèi)，用兩塊半通透膜隔成三個(gè)室，中間室裝待分離液，兩側(cè)室裝水或緩沖液，并裝有電極，接通電源后，帶正電荷的粒子向負(fù)極滲透，而帶負(fù)電荷的粒子向正極滲透，從而達(dá)到分離的目的。此法多用于酶液的脫鹽，去除雜質(zhì)等。

離子交換膜電滲析：其裝置與電荷風(fēng)析一致，只是所用的膜較為特殊，兩塊膜上帶有帶電基團(tuán)，且電性相反，使得帶相同電荷的粒子不能靠近膜，不致于影響膜的通透性。其應(yīng)用范圍與電滲析一致，當(dāng)溶液的濃度較高時(shí)，此法工作效率更高。③擴(kuò)散膜分離：擴(kuò)散膜分離主要是指透析方法，將酶溶液裝在由擴(kuò)散膜制成的透析袋中，再將透析袋置于擴(kuò)散介質(zhì)（緩沖液）中，溶液中的小分子就通過(guò)膜擴(kuò)散出來(lái)，大分子被截留在袋內(nèi)。此法主要用于沒(méi)蛋白的脫鹽；另外此法還可用于酶蛋白的濃縮，當(dāng)濃縮酶蛋白時(shí)，是用高濃度的吸水性較強(qiáng)的擴(kuò)散介質(zhì)，常用的有甘油、聚乙二醇（粉劑）等。第七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提純與精制

一般情況下，工業(yè)上用的大多是經(jīng)過(guò)初步提純和濃縮即可制備成酶制劑；對(duì)于多數(shù)醫(yī)用酶制劑或分析用酶制劑或生化試劑等，則需要進(jìn)行高度提純和精制；另外對(duì)于開(kāi)發(fā)出的新的酶制劑，在投入規(guī)模化生產(chǎn)前，為研究其各種酶蛋白特性和酶學(xué)特性，也需要將酶進(jìn)一步提純和精制。

酶蛋白提純的經(jīng)典程序包括：離子交換層析——分子篩過(guò)濾層析——電泳檢測(cè)純度（必要時(shí)可進(jìn)行制備電泳分離）第八頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提純與精制

1離子交換層析法

（1）離子交換劑：離子交換劑是借酯化、氧化或醚化等化學(xué)反應(yīng)，在瓊脂糖、纖維素或凝膠分子上某些極性基團(tuán)，通過(guò)極性基團(tuán)的靜電吸附作用，對(duì)極性大分子進(jìn)行分離。按離子交換劑上的活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，可分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑兩種。陰離子交換劑：

當(dāng)離子交換劑攜帶陽(yáng)性基團(tuán)，用來(lái)吸附陰離子時(shí)，交換劑稱(chēng)為陰離子交換劑。

目前常用的陰離子交換劑有：

DEAE～纖維素（二乙基氨基乙基纖維素）

DEAE～纖維素適宜用來(lái)分離分子量在10,000-100,000或以上的蛋白質(zhì)，其穩(wěn)定性好，裝柱后，在洗脫過(guò)程中，柱床體積基本保持不變，交換容量大，每克交換劑可吸附0.1—1.1毫克酶蛋白。

DEAE～SephadexA50

DEAE～SephadexA50的交換容量更大，（5.0毫克/克交換劑），但其有一最大的局限性，就是在洗脫過(guò)程中，隨著離子強(qiáng)度的增加柱床體積變小，影響分離效果。

AE～纖維素（氨基乙基纖維素）陽(yáng)離子交換劑：

陽(yáng)離子交換劑有：

CM～纖維素（CM－C，羧甲基纖維素）。弱酸性陽(yáng)離子交換劑。磷酸纖維素（P－C）

中酸性離子交換劑。第九頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提純與精制

1離子交換層析法（2）離子交換分離酶蛋白的基本原理：

一般情況下，酶蛋白的等電點(diǎn)在pH7以下，所以在偏堿性溶液中，酶蛋白帶負(fù)電荷，所以多用陰離子交換劑；（有些酶蛋白等

電點(diǎn)較高，可以將其置于偏酸性溶液中，這樣酶蛋白就帶正電荷，分離純化時(shí)應(yīng)選用陽(yáng)離子交換劑）。在同一pH條件下，由于不同的蛋白質(zhì)所帶電荷不同，其與交換劑的親和力不同，通過(guò)梯度增加洗脫劑的離子強(qiáng)度，按蛋白質(zhì)與交換劑親和力的由小到大，依次被洗脫下來(lái)，達(dá)到分離的目的。第十頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提純與精制

1離子交換層析法

離子交換拄層析基本程序及要點(diǎn)：（以DEAE～纖維素為例）

①離子交換劑的處理：首先將DEAE～纖維素用蒸餾水浸泡溶漲，然后按：0.5N鹽酸處理30分鐘以上（不斷攪拌）→蒸餾水反復(fù)洗滌致中性→0.5N氫氧化鈉處理30分鐘（不斷攪拌）→蒸餾水洗滌致中性。

②洗脫液pH的確定：采用pH梯度測(cè)定。按10％交換當(dāng)量加入離子交換劑和酶蛋白振蕩保溫20－30min靜止后，測(cè)定上清夜的酶活力到?jīng)]有酶活力測(cè)出的試管pH＋1，即為離子交換洗脫液的最適pHpH1pH2pH3pH6pH5pH4pH7④平衡：裝柱后，用洗脫液進(jìn)行平衡過(guò)夜，流述稍大于洗脫流述，使流出緩沖液的pH與流入的相同。⑤上樣和平衡：為達(dá)到良好的分離效果，上樣量一般為其交換容量的10—20%，樣品的pH值和離子強(qiáng)度應(yīng)與洗脫液一致。上樣后用洗脫Buffer平衡。洗脫曲線：⑦分部收集：利用自動(dòng)分部收集器收集。⑥洗脫：上樣后，首先用平衡洗脫液洗脫，主要是洗脫下那些與交換劑結(jié)合力很小或不結(jié)合的雜蛋白；然后，通過(guò)改變洗脫液的離子強(qiáng)度進(jìn)行梯度洗脫梯度洗脫公式為：

Ｃ=C2－(C2－C1)(1－v/V)A2/A1C2：洗脫液的極限離子濃度；C1：初始離子濃度；

v：洗脫液流出體積；V：貯液室和混合室的總體積；A2：貯液室的截面積；A1：混合室的截面積；

當(dāng)A2/A1等于1時(shí)，上述公式代表一個(gè)直線梯度變化；當(dāng)小于1時(shí)，為凹形梯度變化；當(dāng)大于1時(shí)，為凸形梯度變化。

③裝柱：將交換劑攪拌懸浮起來(lái)，抽氣處理，然后用傾倒法裝柱。(8)收集與濃縮第十一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提純與精制

2分子篩層析法（1）分子篩層析法基本原理

凝膠過(guò)濾法是以不同蛋白質(zhì)的分子量大小差異來(lái)將不同蛋白質(zhì)分開(kāi)的方法。最常用的凝膠是葡聚糖凝膠（Sephadex),是由葡聚糖和3-1,2環(huán)氧化丙烷（交聯(lián)劑）相互交聯(lián)而成的中央帶有微孔的球狀凝膠顆粒，根據(jù)凝膠分子的交聯(lián)程度的不同，共有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等8種型號(hào)，G50以下的為硬膠，G75以上的為軟膠。G10的交聯(lián)度最高，分子內(nèi)的網(wǎng)孔最??；G200的交聯(lián)度最低，分子內(nèi)網(wǎng)孔最大。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同，在通過(guò)層析柱時(shí)，走的路程不同，從而分開(kāi)。

（2）凝膠的選擇：

G25以下主要用于脫鹽和氨基酸，或用于分離分子量在5000以下的小肽。

G50主要用于分離分子量1500—30000的小分子蛋白。

G753000—80000G1004000—150000G1505000—300000G2005000—600000（3）凝膠的溶脹：

凝膠規(guī)格融脹體積（ml/g)時(shí)間/h.20C時(shí)間/h.90-100CG102－331G152.5-3.531G254-631G509-1131G7512-15243G10015-20723G15020-30725G20030-40725

(4)裝柱：裝柱前必須進(jìn)行凝膠脫氣處理，裝柱要求同離子交換層析

（5）裝柱效果檢測(cè)：

用帶有顏色的大分子上樣，然后洗脫，檢測(cè)樣品走柱的介面效果，常用藍(lán)色葡聚糖－2000。

（6）上樣：

和離子交換層析有根本不同。主要考慮上樣體積，一般控制在1％－10％。視具體情況而定。

（7）洗脫

洗脫劑可以用低濃度Buffer，也可用蒸餾水；在洗脫過(guò)程中，主要控制兩個(gè)參數(shù)：流速和有效操