大腸桿菌非中斷雜交-李冠喬

大腸桿菌非中斷雜交實驗崔麗嘉2009011868生97同組成員：林逸璁實驗日期：2011年4月8日星期五=1\*ROMANI．實驗?zāi)康?、了解細(xì)菌有性雜交的原理，理解F+菌株、F-菌株和Hfr菌株之間的關(guān)系。2、掌握利用非中斷雜交法進(jìn)行基因定位的原理和技術(shù)。=1\*ROMANI=1\*ROMANI.實驗原理大腸桿菌帶有F因子的菌株能夠與不帶F因子的菌株（F-菌株）進(jìn)行雜交進(jìn)而發(fā)生基因重組。帶有F因子的細(xì)菌，細(xì)胞表面會形成一種與細(xì)胞接合作用相關(guān)的毛狀突起，被稱為性纖毛，長約1-20μm。性纖毛促使供體和受體細(xì)胞特異地配對，在受體細(xì)胞上有纖毛的特異結(jié)合位點，當(dāng)性纖毛結(jié)合到這些特異性位點之后，開始收縮并將2個細(xì)菌拉攏形成作為遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移通道的接合管，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移就開始了。F’因子含有供體細(xì)胞的特定基因而在和F-菌株雜交中期高頻傳遞作用形成部分二倍體，這種通過F’因子介導(dǎo)的供體菌向受體菌特定基因的轉(zhuǎn)移被稱為性導(dǎo)（sexduction）。非中斷雜交：不同的高頻重組品系（Hfr）中F因子與主染色體的整合位置是不同的。Hfr菌株與F-菌株進(jìn)行結(jié)合，染色體由Hfr向F-轉(zhuǎn)移，由于染色體的轉(zhuǎn)移是單方向性的，染色體上的基因都是連鎖的，所以，位于Hfr染色體上前面的基因（接近O點）將有更多的機(jī)會出現(xiàn)在F-中，越是后端的基因出現(xiàn)的機(jī)會就越少。=1\*ROMANI=1\*ROMANI=1\*ROMANI.實驗材料和用具（1）菌株供體菌：E.coliCSH60Hfrstrs受體菌：E.coli57BF-缺陷型（met-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-strr）（2）實驗試劑培養(yǎng)基的配制過程中所使用的試劑，請參見下文中實驗步驟部分。=4\*ROMANIV．實驗過程和步驟1．材料的準(zhǔn)備和培養(yǎng)基配制（1）液體BP培養(yǎng)基：按下表1配方配制培養(yǎng)基，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)以1.034×105Pa壓力滅菌20min，如配制固體培養(yǎng)基則加入20.0g/L的瓊脂即可。表1BP培養(yǎng)基、實驗用磷酸緩沖液、生理鹽水配方項目內(nèi)容質(zhì)量BP培養(yǎng)基（pH=7.2）牛肉膏蛋白胨NaCl葡萄糖蒸餾水5g10g5g5g1000g實驗用磷酸緩沖液（pH=7.0）K2HPO4KH2PO4(NH4)2SO4檸檬酸鈉（Na3C6H5O7）蒸餾水10.5g4.5g1.0g1.0g1000g生理鹽水NaCl蒸餾水8.5g1000g（2）10×A磷酸緩沖液：按表1配方配置10×母液，即將溶質(zhì)提高到配方中的10倍，高壓蒸汽滅菌1.034×105Pa20min。（3）生理鹽水：按表1配方，高壓蒸汽滅菌1.034×105Pa20min。（4）200.0g/L糖溶液：葡萄糖、乳糖、半乳糖每種各取20g，分別溶入100mL蒸餾水中。高壓蒸汽滅菌5.516×104Pa15min。（5）0.25M硫酸鎂溶液：稱取MgSO4?7H2O15.4g加入蒸餾水250mL。（6）鹽酸硫胺素（VBI）：稱取鹽酸硫胺素10mg加水至10mL。高壓蒸汽滅菌5.516×104Pa15min。（7）鏈霉素溶液：取100萬單位的鏈霉素一瓶，加蒸餾水至20mL，不需滅菌。（8）氨基酸溶液及腺嘌呤：精氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、色氨酸、組氨酸、腺嘌呤，配置以上溶液時分別稱取40mg加蒸餾水4mL，然后濾膜過濾或恒溫50℃滅菌50~60min。（9）配制A平板培養(yǎng)基：按表2配方配制。（10）根據(jù)下表3進(jìn)行選擇培養(yǎng)基的配制。表2A平板培養(yǎng)基配方項目內(nèi)容體積或質(zhì)量備注A平板10A緩沖液200.0g/L葡萄糖鹽酸硫胺素0.25M硫酸鎂氨基酸及腺嘌呤溶液鏈霉素溶液瓊脂蒸餾水50mL10mL2mL2mL每種分別加入0.4L2mL10g500mL10mg/mL50mg/mLpH=7.0~7.2表3選擇培養(yǎng)基配表編號選擇標(biāo)記碳源strargilvmetleuadetrphisAmetleustr葡萄糖＋＋＋－－＋＋＋Barg(metleustr)葡萄糖＋－＋－－＋＋＋Cade(metleustr)葡萄糖＋＋＋－－－＋＋Dtrp(metleustr)葡萄糖＋＋＋－－＋－＋Ehis(metleustr)葡萄糖＋＋＋－－＋＋－Flac(metleustr)乳糖＋＋＋－－＋＋＋Ggal(metleustr)半乳糖＋＋＋－－＋＋＋注：ilv為異亮氨酸和纈氨酸ProceduresNotes活化菌種擴(kuò)大培養(yǎng)挑菌至5mLBP培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)16h。分別吸取供體和受體菌1mL轉(zhuǎn)入到另一新5mLBP培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3h林老師和助教們提前完成雜交分別吸取供體菌0.2mL、受體菌4mL混合，置于搖床內(nèi)震蕩培養(yǎng)1.5h。供體菌多于受體菌雜交菌液培養(yǎng)用5倍和10倍稀釋法稀釋，吸取0.1mL均勻涂布A平板供體和受體菌都不能生長，所以在A培養(yǎng)基上長出的菌落即為重組型的重組體檢測找那些菌落分離清晰的進(jìn)行轉(zhuǎn)移，接種在B~G培養(yǎng)基進(jìn)行重組體的鑒定統(tǒng)計菌落恒溫培養(yǎng)根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果將連鎖的基因做出連鎖圖。=4\*ROMANV．實驗現(xiàn)象和結(jié)果1、觀察實驗結(jié)果：培養(yǎng)基BCDEFG生長菌數(shù)55/7228/7227/7222/7225/7217/722、重組率計算：重組率=（選擇性培養(yǎng)基生長菌數(shù)/點總菌數(shù)）×100%培養(yǎng)基B(Arg)C(Ade)D(Trp)E(His)F(Lac)G(Gal)總生長菌數(shù)/點菌總數(shù)55/7228/7227/7222/7225/7217/72重組率76.3%38.9%37.5%30.5%34.7%23.6%3、繪制大腸桿菌基因連鎖圖：由上表得到Arg，Ade，Trp，His，Lac，Gal，Met和Leu從近到遠(yuǎn)的排列順序為：(Met-Leu)-Arg-Ade-Trp-Lac-His-Galtrp基因ade基因gal基因lac基因his基因trp基因ade基因gal基因lac基因his基因arg基因<誤差分析>此結(jié)果與已知相差不大，誤差主要體現(xiàn)在ade與gal的相互位置。我認(rèn)為最主要的誤差來源于我們組的培養(yǎng)基因缺水而龜裂，導(dǎo)致了G盤近1/3點的菌落沒有長，這就直接影響了個數(shù)。而且，其它的盤子中，也出現(xiàn)了外圍干裂的現(xiàn)象。再有，實驗中，9-1組同學(xué)之前點菌時，是一個菌落點在相同的板子上6次，就導(dǎo)致了出現(xiàn)了隔行長菌的現(xiàn)象。因此我對此現(xiàn)象下的菌落個數(shù)表示懷疑。菌斑計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，我和譚驍同樣分別數(shù)一個盤子，菌斑個數(shù)就能相差近20個，我們采取的是共同判斷法。此外，在本次實驗的點樣數(shù)量約200個，數(shù)量不是非常多，因而從統(tǒng)計學(xué)的角度而言其結(jié)果可能會與實際情況有一定偏差。4、計算基因間的圖距：根據(jù)遺傳書《genetics——fromgenestogenomes》(the3rdedition)中Figure15.15和Figure15.16中的相關(guān)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)圖距與重組率的倒數(shù)有較好的線性相關(guān)關(guān)系，由此以ori到lac的圖距定義為1，則計算如下基因ArgAdeTrpLacHisGal重組率76.3%38.9%37.5%34.7%30.5%23.6%1/重組率1.312.572.672.883.284.24相對圖距11.962.042.202.503.24=4\*ROMANVI．實驗討論和思考題1、與中斷雜交的區(qū)別：非中斷雜交的實驗原理是給足夠長的時間，讓能轉(zhuǎn)入的片段都轉(zhuǎn)入進(jìn)去，決定基因會不會重組的不是時間而是到這個長度的時候是不是斷裂了。中斷雜交是依靠時間上來判段，離ori越遠(yuǎn)的越晚轉(zhuǎn)入，所以以轉(zhuǎn)入的時間來標(biāo)志該基因的圖距。非中斷雜交是離ori越遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)入的頻率越低，所以以重組率來與基因距離相關(guān)。那么這就涉及到一個問題，計算圖距的時候我們就要考慮這個實驗本身能不能夠定量，其得到的結(jié)果是不是相對保守，即實驗的可重復(fù)性如何。那我們就容易想到中斷雜交實驗是可以的，因為只要實驗條件一樣，5分鐘的時候速度決定轉(zhuǎn)不到那里進(jìn)不去就是進(jìn)不去，這個實驗的可重復(fù)性應(yīng)該是比較高的。但是我們做的這個非中斷雜交就不一樣了，斷不斷裂這個東西本身就比較隨機(jī)，所以可以預(yù)想到對不同的細(xì)菌體這個情況都不會很一致，對比其它組的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這個組與組之間重組率的差別確實很大，即重組率這個數(shù)據(jù)的可重復(fù)性不好，所以我認(rèn)為這個實驗得到的圖距數(shù)據(jù)保守性不好，這個實驗本身更多應(yīng)該是定性的實驗而不是定量的實驗。2、實驗中的注意事項和遇到的問題：（1）無菌操作這個實驗的無菌操作是比較重要的。操作上一定要靠近酒精燈，來營造無菌環(huán)境。吳老師的理論“有菌的一定不要碰無菌的，無菌的盡量不要碰無菌的”很重要，動手之前先想想什么是無菌的，怎么接觸，怎么做，想好了再做能夠避免不必要的污染。（2）點菌方法應(yīng)該輕輕沾一下，否則菌落在孔里面長，很難判斷它是不是生長了。3、什么是高重組品系？當(dāng)F因子整合入細(xì)胞染色體的時候，產(chǎn)生了高頻重組的Hfr品系，高頻重組品系和F+菌株有相似的雜交特性，但和F-菌株雜交時發(fā)生重組的頻率更高，為10-4，產(chǎn)生后代為F-菌株。4、以大腸桿菌為例說明原和生物與真和生物基因傳遞和重組的異同。相同點：都是異源DNA進(jìn)入細(xì)胞的過程。不同點：向單個真核細(xì)胞傳遞基因主要靠轉(zhuǎn)染，是通過病毒介導(dǎo)的；而真核生物世代間的基因傳遞主要靠減數(shù)分裂和受精作用完成；原核細(xì)胞傳遞基因有多種途徑，包括轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等。基因重組方面，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的DNA重組都發(fā)生在同源區(qū)段，以利配對。但原核生物的基因重組發(fā)生的時間比較隨意，重組率低；而真核生物的基因重組需要發(fā)生在特定的細(xì)胞時相（減I前期的交叉互換，及減I后期的自由組合），并且重組率相對較高。此外，大腸桿菌重組形成部分二倍體或部分合子，且只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生平衡的重組子，相反的重組子不會出現(xiàn)。5、如何證明細(xì)菌重組是由雜交產(chǎn)生的，而不是由回復(fù)突變產(chǎn)生的？一般來講可以在雜交之前將兩個親本各涂這樣一組板作為control，其預(yù)期的結(jié)果是這兩個親本在A~G培養(yǎng)基上都不生長，即可證明細(xì)菌生長是由雜交重組產(chǎn)生的，而不是由回復(fù)突變產(chǎn)生的。由于全班用的是一樣的菌液，所以這樣的control全班做一組就可以了。5、如何證明細(xì)菌的接合是異宗配合？細(xì)菌的異宗配合是指細(xì)菌也有所謂的“性別”，遺傳物質(zhì)只能由“雄性”細(xì)菌傳遞給“雌性”細(xì)菌。要證明異宗配合，可準(zhǔn)備四種細(xì)菌，例如①“F+可利用乳糖”、②“F+不可利用乳糖”、③“F-可利用乳糖”以及④“F-不可利用乳糖”。分別混合①④和②③，若發(fā)現(xiàn)只有①④產(chǎn)生的重組子可以利用乳糖，而②③產(chǎn)生的重組子仍不能利用乳糖，就說明配合過程中，基因只從“雄性F+”細(xì)菌傳遞到了“雌性F-”細(xì)菌，而不能按相反的方向傳遞。6、F+菌株Hfr菌株分別與F-菌株雜交產(chǎn)生重組頻率不同的原因是什么？對Hfr×F-接合來說，早轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的DNA立即與受體染色體上同源區(qū)段發(fā)生重組，因此重組頻率很高。而對于F+×F-來講，與質(zhì)粒序列同源的區(qū)段較少，因此不容易發(fā)生重組。7、在步驟3雜交中，為什么雜交液中受體菌的濃度遠(yuǎn)大于供體菌的濃度？使雜交更充分，保證能夠得到不同營養(yǎng)缺陷型的重組菌落。3．實驗討論與體會這次實驗時間長達(dá)三周，但是卻培養(yǎng)了我們的合作意識以及相對無菌操作的訓(xùn)練。點菌時，我們采取的方式是來回輪轉(zhuǎn)法。前一人點完菌的盤子后一個人接著點，又節(jié)省時間，又有緊張感。數(shù)菌落是困擾我們的一大難題。長沒長？是印記還是菌落？真是糾結(jié)……最后我們采取的方法是看菌落的暈是圓的，突出的，就確定為生長的菌落。這次實驗還是非常有趣的，因為遺傳課上剛剛講過，所以，特別親切。也學(xué)到了不少的知識~=