23-丁二醇對(duì)細(xì)胞周期的影響

2，3-丁二醇對(duì)細(xì)胞周期的影響 概述：了解白酒酒體中各風(fēng)味物質(zhì)對(duì)人體健康的影響，提高白酒酒體中功能活性物質(zhì)的含量，降低酒體中有害成分已成為今后研究的一個(gè)重要方向。1緒論1.1研究背景世界六大蒸餾酒之一——白酒，是中國(guó)獨(dú)有的蒸餾酒。從古至今，中國(guó)白酒因其獨(dú)特濃郁的風(fēng)味受到中國(guó)乃至世界人民的喜愛。隨著人民日益增長(zhǎng)的物質(zhì)文化需要到人民日益增長(zhǎng)的美好生活需要的轉(zhuǎn)變，健康在美好生活中的地位不容忽視，越來越多的人開始關(guān)注白酒對(duì)人體健康的影響。傳統(tǒng)認(rèn)為白酒有活血通脈、增進(jìn)食欲、消除疲勞等功效。研究表明飲用少量低度白酒可以擴(kuò)張小血管，可使血液中的含糖量降低,促進(jìn)血液循環(huán)，延緩膽固醇等脂質(zhì)在血管壁的沉積，對(duì)循環(huán)系統(tǒng)及心腦血管有利。然而白酒中含有大量具有獨(dú)特風(fēng)味的微量物質(zhì)，這些物質(zhì)雖然在白酒總體中含量較低，但種類繁多、成分復(fù)雜，因此需要大量的科學(xué)研究才能最終得出白酒對(duì)人體健康的影響。原發(fā)性肝癌（primacylivercancer，PLC）作為全球范圍內(nèi)較為常見的惡性腫瘤疾病之一，在我國(guó)有著較高的臨床發(fā)病率，且呈逐年上升趨勢(shì)房達(dá),趙乾,杜寧,等.肝癌放,射介入治療患者輻射劑量的分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，41（3）：454-457.DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2020.03.024.。我國(guó)PLC的主要危險(xiǎn)因素是乙型肝炎病毒（HBV）的感染，隨著酒精性肝病成為第二肝病病因，僅次于病毒性肝炎，飲酒與PLC的關(guān)系也越來越受到重視孫曉艷，王炳元.飲酒與肝癌[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（7）：1007.。Meta分析結(jié)合不同研究結(jié)果合并后得出計(jì)飲酒的合并OR值為1.87，表明飲酒是原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)因素，可增加患原發(fā)性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)李輝，劉詩義，劉健，等.飲酒和HBsAg與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)聯(lián)性研究[J].醫(yī)藥論壇雜志，2015，36（5）：12-13.。房達(dá),趙乾,杜寧,等.肝癌放,射介入治療患者輻射劑量的分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，41（3）：454-457.DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2020.03.024.孫曉艷，王炳元.飲酒與肝癌[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（7）：1007.李輝，劉詩義，劉健，等.飲酒和HBsAg與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)聯(lián)性研究[J].醫(yī)藥論壇雜志，2015，36（5）：12-13.傳統(tǒng)上人們經(jīng)常將白酒與有害健康以及酗酒等問題相聯(lián)系，而往往忽略了白酒復(fù)雜酒體體系中對(duì)健康有益并可以減輕酒精傷害的另一部分微量成分徐巖,范文來,葛向陽,等.科學(xué)認(rèn)識(shí)中國(guó)白酒中的生物活性成分[J].釀酒科技,2013(9):1-6.DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2013.09.001.。國(guó)內(nèi)外的研究證實(shí)了酒類飲料或白酒具有一定的保健作用。Petrick等PETRICK徐巖,范文來,葛向陽,等.科學(xué)認(rèn)識(shí)中國(guó)白酒中的生物活性成分[J].釀酒科技,2013(9):1-6.DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2013.09.001.PETRICKJL,CAMPBELLPT,KOSHIOLJ,etal.Tobacco,alcoholuseandriskofhepatocellularcarcinomaandintrahepaticcholangiocarcinoma:thelivercancerpoolingproject[J].BritishJournalofCancer,2018,118(7):1005-1012.DOI:10.1038/s41416018-0007-z.1.2白酒中微量物質(zhì)的研究進(jìn)展：魏夢(mèng)嬌魏夢(mèng)嬌.飲用酒暴露誘導(dǎo)小鼠肝腎組織的毒性效應(yīng)及其分子機(jī)制[D].山西大學(xué),2020.在研究飲用酒暴露誘導(dǎo)小鼠肝腎組織毒性中，引用在相同酒精度數(shù)下，單純給予酒精對(duì)大鼠肝臟的損傷程度要比飲用酒的嚴(yán)重，表明飲用酒內(nèi)的某些成分可以對(duì)抗乙醇對(duì)肝臟的損傷,并且通過研究重建小鼠灌胃模型（微量有機(jī)組分含量提高的飲用酒干預(yù)模型）通過分子機(jī)制驗(yàn)證了飲用酒中這些微量有組分（乙酸、乙酸乙酯、乳酸和乳酸乙酯）可以減輕乙醇誘導(dǎo)肝損傷。因此可以推論出白酒中其他的微量成分也具有研究?jī)r(jià)值。魏夢(mèng)嬌.飲用酒暴露誘導(dǎo)小鼠肝腎組織的毒性效應(yīng)及其分子機(jī)制[D].山西大學(xué),2020.白酒中很多微量成分對(duì)人體有益，有機(jī)酸：沒食子酸可以防治過敏疾病KIMSH,JUNCD,SUKK,etal.Gallicacidinhibitshistaminereleaseandpro-inflammatorycytokineproductioninmastcells[J].ToxicologicalSciences,2006,91(1):123-131.DOI:10.1093/toxsci/kfj063.；阿魏酸有很好的抗氧化能力，具有清除超氧陰離子自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的作用MARIMUTHUS,SUDHEERAR,MENONVP.Ferulicacid:therapeuticpotentialthroughitsantioxidantproperty[J].JournalofClinicalBiochemistry&Nutrition,2007,40(2):92-100.DOI:10.3164/jcbn.40.92.。KIMSH,JUNCD,SUKK,etal.Gallicacidinhibitshistaminereleaseandpro-inflammatorycytokineproductioninmastcells[J].ToxicologicalSciences,2006,91(1):123-131.DOI:10.1093/toxsci/kfj063.MARIMUTHUS,SUDHEERAR,MENONVP.Ferulicacid:therapeuticpotentialthroughitsantioxidantproperty[J].JournalofClinicalBiochemistry&Nutrition,2007,40(2):92-100.DOI:10.3164/jcbn.40.92.乙酸乙酯可以治療乳腺癌張靜,單保恩,劉剛?cè)?等.香加皮乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的研究[J].腫瘤,2006,26(5):418-421;439.DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2006.05.003.、舒張血管蔣惠娣,王玲飛,周新妹,等.杭白菊乙酸乙酯提取物的舒血管作用及相關(guān)機(jī)制[J].中國(guó)病理生理雜志,2005,21(2):334-338.DOI:10.3321/j.issn:1000-4718.2005.02.029.；丁酸乙酯可以穩(wěn)定人的情緒張靜,單保恩,劉剛?cè)?等.香加皮乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的研究[J].腫瘤,2006,26(5):418-421;439.DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2006.05.003.蔣惠娣,王玲飛,周新妹,等.杭白菊乙酸乙酯提取物的舒血管作用及相關(guān)機(jī)制[J].中國(guó)病理生理雜志,2005,21(2):334-338.DOI:10.3321/j.issn:1000-4718.2005.02.029.AZABAN,MEHTADV,CHESEBROJE,etal.Ethylbutyrate,avalproate-likecompound,exhibitsinositol-depletingeffects:apotentialmood-stabilizingdrug[J].LifeSciences,2009,84(1/2):3844.DOI:10.1016/j.lfs.2008.10.016.萜烯物質(zhì)種類豐富，而且大部分物質(zhì)如：β-石竹烯、茴香腦、欖香烯和β-桉葉油醇等萜烯類物質(zhì)具有抗氧化DAHHAMSS,TABANAYM,IQBALMA,etal.Theanticancer,antioxidantandantimicrobialpropertiesofthesesquiterpeneβ-caryophyllenefromtheessentialoilofAquilariacrassna[J].Molecules,2015,20(7):11808-11829.DOI:10.3390/molecules200711808.、抗癌CHAINYGBN,MANNASK,CHATURVEDIMM.Anetholeblocksbothearlyandlatecellularresponsestransducedbytumornecrosisfactor:effectonNF-kappaB,AP-1,JNK,MAPKKandapoptosis[J].Oncogene,2000,19(25):2943-2950.DOI:10.1038/sj.onc.1203614.LIQQ,WANGGD,HUANGFR,etal.Antineoplasticeffectofbeta-elemeneonprostatecancercellsandothertypesofsolidtumourcells[J].JournalofPharmacyandPharmacology,2010,62(8):10181027.DOI:10.1111/j.2042-7158.2010.01135.x.MAEL,LIYC,TSUNEKIH,etal.Beta-eudesmolsuppressestumourgrowththroughinhibitionoftumourneovascularisationandtumourcellproliferation[J].JournalofAsianNaturalProductsResearch,2008,10(1/2):159-167.DOI:10.1080/10286020701394332.等生理學(xué)功能，同時(shí)也能改善白酒風(fēng)味。DAHHAMSS,TABANAYM,IQBALMA,etal.Theanticancer,antioxidantandantimicrobialpropertiesofthesesquiterpeneβ-caryophyllenefromtheessentialoilofAquilariacrassna[J].Molecules,2015,20(7):11808-11829.DOI:10.3390/molecules200711808.CHAINYGBN,MANNASK,CHATURVEDIMM.Anetholeblocksbothearlyandlatecellularresponsestransducedbytumornecrosisfactor:effectonNF-kappaB,AP-1,JNK,MAPKKandapoptosis[J].Oncogene,2000,19(25):2943-2950.DOI:10.1038/sj.onc.1203614.LIQQ,WANGGD,HUANGFR,etal.Antineoplasticeffectofbeta-elemeneonprostatecancercellsandothertypesofsolidtumourcells[J].JournalofPharmacyandPharmacology,2010,62(8):10181027.DOI:10.1111/j.2042-7158.2010.01135.x.MAEL,LIYC,TSUNEKIH,etal.Beta-eudesmolsuppressestumourgrowththroughinhibitionoftumourneovascularisationandtumourcellproliferation[J].JournalofAsianNaturalProductsResearch,2008,10(1/2):159-167.DOI:10.1080/10286020701394332.豐富的吡嗪物質(zhì)很多都是有益成分，如：2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等均具有抗氧化功能孫惜時(shí),李文華,李榮,等.芝麻香型白酒中硫化物和吡嗪類成分的抗氧化活性[J].釀酒,2013,40(4):57-60.DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2013.04.017.，而四甲基吡嗪則是白酒中最為主要的吡嗪物質(zhì)，它是中藥川穹的主要成分，具有抑制腫瘤FUYS,LINYY,CHOUSC,etal.Tetramethylpyrazineinhibitsactivitiesofgliomacellsandglutamateneuro-excitotoxicity:potentialtherapeuticapplicationfortreatmentofgliomas[J].Neuro-Oncology,2008,10(2):139-152.DOI:10.1215/15228517-2007-051.孫惜時(shí),李文華,李榮,等.芝麻香型白酒中硫化物和吡嗪類成分的抗氧化活性[J].釀酒,2013,40(4):57-60.DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2013.04.017.FUYS,LINYY,CHOUSC,etal.Tetramethylpyrazineinhibitsactivitiesofgliomacellsandglutamateneuro-excitotoxicity:potentialtherapeuticapplicationfortreatmentofgliomas[J].Neuro-Oncology,2008,10(2):139-152.DOI:10.1215/15228517-2007-051.當(dāng)前報(bào)道的白酒中微量成分物質(zhì)較多，僅定性物質(zhì)就包括酸類、酯類、醇類、醛類、吡嗪、萜烯等2000多種，其中不乏有多種有益健康的微量成分YAOF,YIB,SHENC,etal.ChemicalanalysisoftheChineseliquorLuzhoulaojiaobycomprehensivetwo-dimensionalgaschromatography/time-of-flightmassspectrometry[J].ScientificReports,2015,5:9553.DOI:10.1038/srep09553.。目前對(duì)白酒微量成分的認(rèn)識(shí)還在初級(jí)階段，還有很多問題需要進(jìn)行深入研究。YAOF,YIB,SHENC,etal.ChemicalanalysisoftheChineseliquorLuzhoulaojiaobycomprehensivetwo-dimensionalgaschromatography/time-of-flightmassspectrometry[J].ScientificReports,2015,5:9553.DOI:10.1038/srep09553.1.32,3-丁二醇研究現(xiàn)狀：2，3-丁二醇(2,3-Butanedio1)是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航空航天等領(lǐng)域，常溫下是一種無色無味的透明液體戴建英,孫亞琴,孫麗慧,等.生物基化學(xué)品2,3-丁二醇的研究進(jìn)展[J].過程工程學(xué)報(bào),2010,10(01):200-208.。戴建英,孫亞琴,孫麗慧,等.生物基化學(xué)品2,3-丁二醇的研究進(jìn)展[J].過程工程學(xué)報(bào),2010,10(01):200-208.白酒中呈味物質(zhì)2，3-丁二醇的形成，主要是在糖化發(fā)酵的后期形成，在這個(gè)時(shí)期，溫度緩慢降低，糖化發(fā)酵作用較弱，但卻是眾多香味物質(zhì)生成的時(shí)期。2，3-丁二醇是二元醇，但它也具有酮的性質(zhì)，并有助香作用，在我國(guó)名優(yōu)白酒中，含量均較高。2，3-丁二醇主要由多粘菌或賽氏桿菌等發(fā)酵而生成陸壽鵬.釀造工藝[M].2002.陸壽鵬.釀造工藝[M].2002.C6H12O6CH3CHOHCHOHCH3+2CO2+H2尹禮國(guó)尹禮國(guó),馮學(xué)愚,許德富,.五糧濃香型白酒黃水微量物質(zhì)分析及應(yīng)用探討[J].釀酒科技,2014(04):83-85.等采用毛細(xì)管柱氣相色譜內(nèi)標(biāo)法分析黃水樣品中66種微量成分并與優(yōu)質(zhì)白酒的微量成分進(jìn)行了對(duì)比分析，其中黃水中含量較高的醇類有6種，其中2,3-丁二醇占總量的87.8%，含量達(dá)1.1212g/L，并且優(yōu)質(zhì)白酒中2,3-丁二醇含量也相對(duì)較高，含量達(dá)0.0384g/L，占第24位。尹禮國(guó),馮學(xué)愚,許德富,.五糧濃香型白酒黃水微量物質(zhì)分析及應(yīng)用探討[J].釀酒科技,2014(04):83-85.2,3-丁二醇屬多元醇，具有甜味幾天和助甜基團(tuán)，也是白酒中甜味的主要來源。瀘香型白酒由于甘油、雙乙酰、2,3-丁二醇含量較高，它們與己酸乙酯配合得當(dāng)時(shí)，構(gòu)成瀘香型酒的典型香、甜風(fēng)味刁治民，魏克家，陳占全等.農(nóng)業(yè)微生物工程學(xué)[M].2007.刁治民，魏克家，陳占全等.農(nóng)業(yè)微生物工程學(xué)[M].2007.2,3-丁二醇在餿香型調(diào)味酒（驗(yàn)收后的合格酒，經(jīng)勾兌成比較全面的基礎(chǔ)酒，在香味或口味的某些方面還有不足。需要通過調(diào)味來加以彌補(bǔ)）中的大量存在，可以解決基礎(chǔ)酒的后澀、苦、后味微雜、香味單調(diào)等缺陷韓珍瓊主編.釀造食品加工技術(shù)[M].2009.韓珍瓊主編.釀造食品加工技術(shù)[M].2009.因此探究2,3-丁二醇的影響是有必要的。1.4研究目的及意義：雖然飲用酒對(duì)動(dòng)物肝臟影響有一定的研究，但對(duì)白酒中微量物質(zhì)，上千種微量成分以及雜糅在一起的對(duì)人體的綜合效應(yīng)的研究較少，甚至對(duì)2，3-丁二醇在食品健康領(lǐng)域方面的探究少之又少，2，3-丁二醇對(duì)肝臟細(xì)胞的影響尚不明確。因此提出本課題，其研究的意義在于：用HepG2肝癌細(xì)胞，通過檢測(cè)氧化應(yīng)激、細(xì)胞衰老、凋亡等反應(yīng)，來看出不同濃度的2，3-丁二醇對(duì)肝臟組織的效應(yīng)。初步探究2，3-丁二醇對(duì)人體健康是否有益。不僅是2，3-丁二醇，白酒中還有很多重要組分需要一一探究并且還要探究復(fù)合組分對(duì)人體的錯(cuò)綜復(fù)雜的影響，最終在對(duì)研究白酒方面提供科學(xué)的依據(jù)。2材料與方法2.1儀器表2-1儀器Table2-1Apparatus名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家CO2培養(yǎng)箱Galaxy170RNewBrunswickScientific倒置熒光顯微鏡IX71OlympusCorporation生物安全柜AirstreamA2型EscoMicroPteLtd電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9146MBE上海博迅實(shí)業(yè)有限公司小型離心機(jī)Centrifuge5418Eppendorf高性能臺(tái)式離心機(jī)X1RThermoFisher超低溫冰箱ThermoScientific核酸蛋白微量檢測(cè)儀SpectraMax190MolecularDevices超聲波細(xì)胞破碎儀JY88-IIN上海滬析實(shí)業(yè)有限公司搖床SLK-O3000-S混勻儀MXW-20DL杭州齊威有限公司電熱恒溫水浴鍋DK-98-II天津泰斯特儀器有限公司冰箱BCD-183KF1TCL家用電器有限公司電泳儀Bio-Rad電子天平AX124ZH/EOHAUS2.2試劑及藥品表2-2試劑及藥品Table2-2ReagentsandMedicines名稱生產(chǎn)廠家DMEM高糖培養(yǎng)基吉諾生物醫(yī)藥胎牛血清（FBS）浙江天杭生物科技青-鏈霉素（雙抗）上海源培生物科技2，3-丁二醇上海易恩化學(xué)鐵氰化鉀上海易恩化學(xué)X-Gal索萊寶生物科技5-溴-2-脫氧尿苷武漢科瑞生物技術(shù)活性氧熒光探針（DFCH-DA）DNA提取酚索萊寶生物科技ProteinaseK北京天根生化溴化乙啶（EB）二甲亞砜（DMSO）噻唑藍(lán)（MTT）二甲雙胍維生素C其他試劑：乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（tris堿）、冰乙酸、檸檬酸、H3PO4、K4Fe(CN)6、MgCl2、NaCl、氯仿、異戊醇、乙醇、甲醛、戊二醛、KH2PO4、Na2HPO4、KCl試劑配置：50xTAE：tris堿（三羥甲基氨基甲烷）12.1g、Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）1.86g、冰乙酸2.855mL、去離子水40ml，最終定容至50ml，待用時(shí)再稀釋至1xTAEX-Gal染色液：K3Fe(CN)6（100mmol/L）；K4Fe(CN)6（100mmol/L）；X-Gal（20mg/L）；MgCl2（1mol/L）；NaCl（5mol/L）；檸檬酸—磷酸緩沖液（檸檬酸0.1mol/L、磷酸0.2mol/L）磷酸緩沖液（PBS）：KCl（2.7mM）、Na2HPO4（8.1mM）、KH2PO4(1.8mM)、NaCl(137mM)2.3實(shí)驗(yàn)方法：2.3.1實(shí)驗(yàn)分組2.3.2細(xì)胞培養(yǎng)2.3.2.1細(xì)胞復(fù)蘇快速從-80℃超低溫冰箱里取出凍存管，快速放進(jìn)37℃水浴鍋緩慢搖晃使細(xì)胞解凍（凍存管的封口膜不要破裂，防止污染），使用移液槍將1mL細(xì)胞全部吸出至10mL無菌EP管，補(bǔ)加9mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，分裝至1.5mL的無菌EP管中，離心（1000rpm、5min）使細(xì)胞沉淀，棄掉上清液。用馬氏管吸取9mL左右基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%胎牛血清，50μl雙抗，輕輕混勻，用吸管將細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶。平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃、5%CO2），培養(yǎng)24小時(shí)后，顯微鏡觀察細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）貼壁后，小心更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2.3.2.2細(xì)胞傳代細(xì)胞長(zhǎng)滿90%-100%即可傳代，打開培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)基。加入1mLPBS，潤(rùn)洗細(xì)胞，重復(fù)3次，棄PBS。加入4mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用無菌吸管小心吹打貼壁細(xì)胞或者用胰蛋白酶消化細(xì)胞使細(xì)胞脫落。移液槍轉(zhuǎn)移1mL脫落的細(xì)胞至新的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加8mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%胎牛血清，50μL雙抗，小心封口，平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃、5%CO2）2.3.2.3細(xì)胞換液：每?jī)扇赵陲@微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待長(zhǎng)滿視野80％左右即可進(jìn)行細(xì)胞換液，取出培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，馬氏管吸取9mL培養(yǎng)基，根據(jù)之前生長(zhǎng)情況，適量增加或減少胎牛血清（按經(jīng)驗(yàn)，后傳代一般為300~600μL），加入50μL雙抗8字形混勻后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃、5%CO2）。2.3.3細(xì)胞形態(tài)觀察:2.3.4對(duì)β-半乳糖苷酶底物染色法研究細(xì)胞衰老：取Hepg2細(xì)胞（24h、48h）800μL細(xì)胞液到1.5mL的ep管中，離心（1500rpm5min）得到細(xì)胞沉淀，去除上清液，加500μLPBS到ep管中，用移液槍吹打混勻，取200μL到蓋玻片上，加固定液（2％甲醛）200μL固定10min，用移液槍吸取300μLPBS沖一次，可適當(dāng)再次用150μL再?zèng)_一次，用X-Gal染色液進(jìn)行染色，充分蓋住細(xì)胞，染色1h，在染色過程中放在超凈工作臺(tái)開風(fēng)機(jī)盡量吹干相當(dāng)水分，染色結(jié)束棄染液，用少量滅菌水沖開染液，不宜過多容易沖走細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果，藍(lán)染為陽性，隨機(jī)視野取500細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞百分率。2.3.5通過測(cè)定Caspase-8活性來研究2，3-丁二醇對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：取Hepg2細(xì)胞（24h、8h）1000g、5分鐘收集細(xì)胞,吸盡上清。每2~10×106細(xì)胞加50~100μL裂解液，放在旋渦混勻器上震蕩裂解，冰浴10分鐘，再次震蕩。4℃、12,000g、10分鐘取上清測(cè)定。按表設(shè)置96孔板反應(yīng)體系。底物最后加入以使各管反應(yīng)起始時(shí)間相同,設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照管。置于37℃飽和溫度,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。Caspase活性增加的百分比=實(shí)驗(yàn)處理組OD/實(shí)驗(yàn)對(duì)照組OD*100%反應(yīng)體系：無樣品空白對(duì)照（低酶）活性樣品反應(yīng)緩沖液μL9560待測(cè)樣品μL—35底物μL55總體積μL1001002.3.6DNAladder測(cè)定：1.提取細(xì)胞中DNA（酚氯仿法）：每組取1mL到EP管中，超聲波破碎細(xì)胞（250w15min每破碎3s間隔5s）；Ep管中加入10μL蛋白酶K，放入搖床（56℃1h）；加入等體積tris飽和酚（DNA提取酚）500μL，搖勻10min，離心（12000rpm7min4℃）[上層DNA中層蛋白質(zhì)下層有機(jī)質(zhì)]；吸取上層液體加入新離心管。配置混合液（tris飽和酚：氯仿：異戊醇=25:24:1）；加入混合液450μL，搖勻10min離心（12000rpm7min4℃）；取上清到新離心管，加等體積（氯仿：異戊醇=24:1）混合液400μL；離心（12000rpm7min4℃）；取上清到新離心管，加2.5倍100％酒精（-20℃預(yù)冷）；-20℃過夜取出離心（12000rpm7min4℃）；棄上清留50μL，留白色沉淀（DNA），待酒精揮發(fā)1h，加滅菌水溶解放入2.瓊脂糖凝膠電泳制備瓊脂糖凝膠：用膠帶紙將洗凈干燥的電泳凝膠床的兩端開口封號(hào)，形成一個(gè)膠膜，平放在工作臺(tái)上。配置50xTAE，使用時(shí)稀釋到1xTAE，加1％瓊脂糖，放入微波爐內(nèi)加熱至溶液澄清（100度），取出搖動(dòng)使瓊脂糖盡快溶解。溶化的瓊脂糖溶液冷卻至不太燙手時(shí)，加入溴化乙啶（EB），使其終濃度為0.5μg/ml，充分搖勻；在膠膜放置好梳子后，將凝膠倒入板中等待凝固進(jìn)行電泳：使用前加入1.5L1xTAE溶液到泳槽，使液面高出凝膠表面1-2mm，將標(biāo)記物及樣品與上樣緩沖液混合，并以依次加入樣品孔