儀器分析毛細(xì)管電泳法

第五章毛細(xì)管電泳法CapillaryElectrophoresis

本章要求

⒈了解電泳、淌度、電滲的概念⒉了解毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu)⒊了解六種毛細(xì)管電泳分離模式5.1基本概念和原理在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在直流電場的作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場方向遷移的現(xiàn)象。陰離子向正極方向遷移，陽離子向負(fù)極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運(yùn)動(dòng)。

利用這些帶電粒子在電場中遷移速度的不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳。1.電泳2.毛細(xì)管電泳：CE以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，利用被分析離子在電場作用下移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的，主要用于分析在毛細(xì)管緩沖溶液中離解為離子的物質(zhì)。毛細(xì)管的內(nèi)徑比頭發(fā)絲還細(xì)得多10-30千伏電壓4.電滲毛細(xì)管內(nèi)充滿溶液pH>3時(shí)，管內(nèi)Si-OH電離SiO-基，毛細(xì)管壁帶負(fù)電，與溶質(zhì)界面上形成雙電層。在雙電層的擴(kuò)散外層中，陽離子向陰極移動(dòng)，帶動(dòng)溶液形成軸向流動(dòng)。在毛細(xì)管中電滲速度可比電泳速度大一個(gè)數(shù)量級，所以能實(shí)現(xiàn)樣品組分同向泳動(dòng)。正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳速度，在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。離子的出峰次序?yàn)椋赫x子>中性分子>負(fù)離子電滲流的作用：㈠可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離。㈡改變電滲流的大小和方向，可改變分離效率和選擇性，也是CE與HPLC相比能優(yōu)化分離的重要因素。㈢電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性，控制電滲流恒定是CE分析關(guān)鍵所在。㈣電滲流在CE中起到像HPLC中的泵一樣作用。1.進(jìn)樣系統(tǒng)電動(dòng)進(jìn)樣；壓力進(jìn)樣；擴(kuò)散進(jìn)樣。進(jìn)樣體積一般在納升級。2.分離系統(tǒng)毛細(xì)管：熔融石英，長40~100cm，內(nèi)徑25~100m；恒溫系統(tǒng)：控制柱溫變化在±0.1℃；高壓電源：電流0~300A，電壓0~30kV(穩(wěn)定性±0.1%)3.檢測系統(tǒng)4.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)紫外-可見檢測器；激光誘導(dǎo)熒光檢測器；電化學(xué)檢測器。5.3毛細(xì)管電泳分離模式6種分離模式：

毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE

毛細(xì)管等速電泳CITP

毛細(xì)管等電聚焦CIEF

毛細(xì)管電色譜CEC膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜MECC

毛細(xì)管凝膠電泳CGE1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)用CZE時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)用一種緩沖溶液(背景電解質(zhì))，根據(jù)各組分荷質(zhì)比不同而分離。背景電解質(zhì)僅起傳導(dǎo)電流的作用。

t＝0

t＞03.毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)基本操作步驟：進(jìn)樣、聚焦和遷移，用于生物大分子的分離。毛細(xì)管等電聚焦電泳的運(yùn)行過程(a)進(jìn)樣；(b)聚焦；(c)遷移4.毛細(xì)管電色譜(CEC)分為填充柱和開管柱兩種方式，可分離離子和中性分子，且可分離手性分子。5.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)兩相：流動(dòng)的水相和起固定相作用的膠束相(準(zhǔn)固定相)，被測組分由于在水相和膠束相之間分配系數(shù)的差異而分離。5.4毛細(xì)管電泳特點(diǎn)及應(yīng)用(1)高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊至數(shù)千萬塊。(2)高靈敏度：可檢測出低至10-20mol濃度的物質(zhì)。(3)高分析速度：可3min內(nèi)分離30種陰離子；1.7min內(nèi)分離19種陽離子；4min內(nèi)分離10種蛋白質(zhì)。(4)試樣用量少：僅需幾nL(10-9L)的試樣。(5)儀器簡單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升。(6)自動(dòng)：CE是目前自動(dòng)化程度最高的分離方法。(7)通常使用水溶液，對人和環(huán)境無害。1.優(yōu)點(diǎn)HPLC中，縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力是影響譜峰展寬的重要因素，而CE只有縱向擴(kuò)散影響譜峰展寬，塔板數(shù)：D:組分?jǐn)U散系數(shù)U：毛細(xì)管兩端施加電壓可采用20000~60000V的高壓，分離速度和分離度有明顯的改善，N為(1~2)105，HPLC的N為5103~2104。理論塔板數(shù)3.應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅在基礎(chǔ)科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有較多應(yīng)用，如臨床疾病診斷、臨床蛋白分析、臨床藥物監(jiān)測、代謝研究、病理研究、PCR產(chǎn)物分析、DNA片段及序列分析等?？蓹z測多種樣品，如血清、血漿、尿樣、腦脊液、紅細(xì)胞、體液或組織及其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。除分離生物大分子（肽、蛋白、DNA、糖等）外，還可用于小分子（氨基酸、藥物等）及離子（無機(jī)、有機(jī)），甚至可以分離各種顆粒（硅膠顆粒等）