雙脫氧末端終止測序法原理-過程和目標(biāo)基因序列拼接和分析

實驗?zāi)康?、通過本實驗了解雙脫氧鏈終止法的基本原理，掌握DNA測序的基本方法；2、學(xué)會序列查詢、核酸及蛋白質(zhì)的同源性搜索和比對。1現(xiàn)在是1頁\一共有42頁\編輯于星期六

DNA測序技術(shù)主要有兩種方法，都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的。A.

雙脫氧鏈終止法（thechainterminationmethod），是通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序。B.

化學(xué)降解法（chemicaldegradationmethod），是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理，產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)記進行測序。一、DNA測序的方法2現(xiàn)在是2頁\一共有42頁\編輯于星期六1.Sanger雙脫氧鏈終止法測序原理

利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國劍橋分子生物學(xué)實驗室的生物化學(xué)家F.Sanger等人于1977年發(fā)明的。3現(xiàn)在是3頁\一共有42頁\編輯于星期六基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3’-末端。因為ddNTP3’不是-OH，不能與下一個核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長。4現(xiàn)在是4頁\一共有42頁\編輯于星期六5現(xiàn)在是5頁\一共有42頁\編輯于星期六2、具體操作：

測序時分成四個反應(yīng),每個反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,C,G,T核苷三磷酸（稱為ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后進行聚合反應(yīng)。在第一個反應(yīng)中,ddATP會隨機地代替dATP參加反應(yīng)，一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈，由于其第3位的-OH變成了-H,所以不能繼續(xù)延伸,于是第一個反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了。6現(xiàn)在是6頁\一共有42頁\編輯于星期六

同理第二個反應(yīng)產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的;第三個反應(yīng)的都以G結(jié)尾,第四個反應(yīng)的都以T結(jié)尾,電泳后就可以讀出序列了.7現(xiàn)在是7頁\一共有42頁\編輯于星期六

假如有一個DNA,互補序列是GATCCGAT,我們試著做一下:

在第一個反應(yīng)中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三個堿基時沒什么問題,但遇到A時,摻入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一個如果參與反應(yīng)的是ddATP則終止,產(chǎn)生一個僅有2個核苷酸的序列:GA,否則繼續(xù)延伸,可以產(chǎn)生序列GATCCG,又到了下一個A了.同樣有兩種情況,如果是ddATP摻入,則產(chǎn)生的序列是GATCCGA,延伸終止,否則可以繼續(xù)延伸,產(chǎn)生GATCCGAT.將得到如下結(jié)果：1產(chǎn)生的都是以A結(jié)尾的片段:GA,GATCCGA。234產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的片段:GATC,GATCC產(chǎn)生的都是以G結(jié)尾的片段:G,GATCCG

產(chǎn)生的都是以T結(jié)尾的片段:GAT,GATCCGAT8現(xiàn)在是8頁\一共有42頁\編輯于星期六

制得的四組混合物全部平行地點加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。

即可得到測序結(jié)果：為GATCCGAT9現(xiàn)在是9頁\一共有42頁\編輯于星期六制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

3、技術(shù)路線：10現(xiàn)在是10頁\一共有42頁\編輯于星期六4、高通量自動化測序DNA序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一方面是指“分析反應(yīng)”的自動化，另一方面是指“讀片過程”的自動化。自動化的DNA序列分析，也是根據(jù)Sanger雙脫氧鏈終止DNA測序法的基本原理發(fā)展起來的。11現(xiàn)在是11頁\一共有42頁\編輯于星期六自動化測序原理

自動化測序類似于PCR反應(yīng)，但只用一條引物，反應(yīng)混合物中含有不同熒光標(biāo)記的ddNTP與4種dNTP。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基。產(chǎn)物條帶經(jīng)過檢測儀時給出特定信號，由計算機判讀并記錄。優(yōu)點：可用雙鏈DNA做模板；模板用量少，不必克隆；可實現(xiàn)高通量自動化。12現(xiàn)在是12頁\一共有42頁\編輯于星期六高速自動DNA測序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理

由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)后被導(dǎo)向凝膠表面的檢測區(qū)。在此，激光束垂直射向凝膠，同經(jīng)過檢測孔的DNA片段發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)熒光發(fā)色基團發(fā)射出具特異性波長的熒光。這些熒光通過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡/棱鏡組件，以便四種堿基產(chǎn)生的不同標(biāo)記波長區(qū)別開來。經(jīng)成像透像最后由高靈敏度的相機分段收集信號，傳送給計算所分析處理。13現(xiàn)在是13頁\一共有42頁\編輯于星期六

熒光化合物標(biāo)記鏈終止法以熒光顏色為標(biāo)記信號，每種ddNTP各有1種代表顏色；整個反應(yīng)在一個試管中進行；當(dāng)新合成的終止單鏈通過熒光監(jiān)測儀時，可由光信號讀出末端核苷酸并由電腦記錄。14現(xiàn)在是14頁\一共有42頁\編輯于星期六15現(xiàn)在是15頁\一共有42頁\編輯于星期六Sanger雙脫氧鏈終止DNA測序法的測序能力：

手工測序：最大約300bp；

自動測序：最大約1200bp。16現(xiàn)在是16頁\一共有42頁\編輯于星期六二、序列比對分析1.相似性與同源性相似性(similarity)：是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合適的度量。比如說，A序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。這是個量化的關(guān)系。當(dāng)然可進行自身局部比較。17現(xiàn)在是17頁\一共有42頁\編輯于星期六同源性(homology)：指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個基因或蛋白質(zhì)序列具而共同祖先的結(jié)論，屬于質(zhì)的判斷。就是說A和B的關(guān)系上，只有是同源序列，或者非同源序列兩種關(guān)系。而說A和B的同源性為80％都是不科學(xué)的。18現(xiàn)在是18頁\一共有42頁\編輯于星期六

序列的相似性和序列的同源性有一定的關(guān)系，一般來說序列間的相似性越高的話，它們是同源序列的可能性就更高，所以經(jīng)?？梢酝ㄟ^序列的相似性來推測序列是否同源。正因為存在這樣的關(guān)系，很多時候?qū)π蛄械南嗨菩院屯葱跃蜎]有做很明顯的區(qū)分，造成經(jīng)常等價混用兩個名詞。所以有出現(xiàn)A序列和B序列的同源性為80％一說。19現(xiàn)在是19頁\一共有42頁\編輯于星期六

序列相似性比較：

就是將待研究序列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫進行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；20現(xiàn)在是20頁\一共有42頁\編輯于星期六

序列同源性分析：

是將待研究序列加入到一組與之同源，但來自不同物種的序列中進行多序列同時比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比較算法。常用的程序包有CLUSTAL等；21現(xiàn)在是21頁\一共有42頁\編輯于星期六2.Blast簡介及應(yīng)用（1）Blast簡介

BLAST是由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）開發(fā)的一個基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序。

BLAST是“局部相似性基本查詢工具”（BasicLocalAlignmentSearchTool）的縮寫。22現(xiàn)在是22頁\一共有42頁\編輯于星期六Blast是一個序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多個獨立的程序，這些程序是根據(jù)查詢的對象和數(shù)據(jù)庫的不同來定義的。比如說查詢的序列為核酸，查詢數(shù)據(jù)庫亦為核酸序列數(shù)據(jù)庫，那么就應(yīng)該選擇blastn程序。

下表列出了主要的blast程序：23現(xiàn)在是23頁\一共有42頁\編輯于星期六主要的blast程序程序名查詢序列數(shù)據(jù)庫搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列Blastx核酸蛋白質(zhì)核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白質(zhì)核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比對。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯成的蛋白質(zhì)序列逐一進行比對。24現(xiàn)在是24頁\一共有42頁\編輯于星期六（2）Blast資源1、NCBI主站點：（網(wǎng)絡(luò)版）

（單機版）2、其他站點：

（果蠅）

…25現(xiàn)在是25頁\一共有42頁\編輯于星期六Blast結(jié)果會列出跟查詢序列相似性比較高，符合限定要求的序列結(jié)果，根據(jù)這些結(jié)果可以獲取以下一些信息：

1.查詢序列可能具有某種功能；

2.查詢序列可能是來源于某個物種；

3.查詢序列可能是某種功能基因的同源基因；

…

這些信息都可以應(yīng)用到后續(xù)分析中。26現(xiàn)在是26頁\一共有42頁\編輯于星期六（3）Blast應(yīng)用登陸ncbi的blast主頁核酸序列蛋白序列翻譯序列底下有其他一些針對特殊數(shù)據(jù)庫的和查看以往的比對結(jié)果等27現(xiàn)在是27頁\一共有42頁\編輯于星期六Blast任務(wù)提交表單11.序列信息部分填入查詢（query）的序列序列范圍（默認(rèn)全部）選擇搜索數(shù)據(jù)庫如果接受其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置，點擊開始搜索28現(xiàn)在是28頁\一共有42頁\編輯于星期六Blast任務(wù)提交表單2設(shè)置搜索的范圍，entrez關(guān)鍵詞，或者選擇特定物種2.設(shè)置各種參數(shù)部分一些過濾選項，包括簡單重復(fù)序列，人類基因組中的重復(fù)序列E值上限窗口大小如果你對blast的命令行選項熟悉的話，可以在這里加入更多的參數(shù)29現(xiàn)在是29頁\一共有42頁\編輯于星期六Blast任務(wù)提交表單33.設(shè)置結(jié)果輸出顯示格式選擇需要顯示的選項以及顯示的文件格式顯示數(shù)目Alignment的顯示方式篩選結(jié)果E值范圍其他一些顯示格式參數(shù)點擊開始搜索30現(xiàn)在是30頁\一共有42頁\編輯于星期六提交任務(wù)返回查詢號（requestid）可以修改顯示結(jié)果格式修改完顯示格式后點擊進入結(jié)果界面31現(xiàn)在是31頁\一共有42頁\編輯于星期六結(jié)果頁面1圖形示意結(jié)果32現(xiàn)在是32頁\一共有42頁\編輯于星期六結(jié)果頁面2目標(biāo)序列描述部分帶有g(shù)enbank的鏈接，點擊可以進入相應(yīng)的genbank序列匹配情況，分值，e值33現(xiàn)在是33頁\一共有42頁\編輯于星期六結(jié)果頁面3詳細(xì)的比對上的序列的排列情況34現(xiàn)在是34頁\一共有42頁\編輯于星期六（4）一個例子假設(shè)以下為一未知蛋白序列>query_seqMSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA