基因組學(xué)功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)

人類基因組計(jì)劃的啟動

1986年諾貝爾獎獲得者R.Dulbecco（杜爾貝科）提出人類基因組計(jì)劃——測出人類全套基因組的DNA堿基序列（3X109bp）現(xiàn)在是1頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3111975年，獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎 現(xiàn)在是2頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/312

美國政府決定于1990年正式啟動HGP，預(yù)計(jì)用15年時(shí)間，投入30億美元，完成HGP。

由國立衛(wèi)生研究院和能源部共同組成“人類基因組研究所”

逐漸地，HGP擴(kuò)展為多國協(xié)作計(jì)劃。參與者包括：英、日、法、德和中國（1993年）現(xiàn)在是3頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/313DNA測序技術(shù)飛速提高

1998.5.9J.C.Venter等宣布，組建商

業(yè)公司，投入3億美元，3年內(nèi)完成。接著又有若干家公司成立，

總共投入資金約幾十億美元，形成

“公”“私”并進(jìn)格局現(xiàn)在是4頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/314現(xiàn)在是5頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/315二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成現(xiàn)在是6頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/316人類基因組草圖基本信息由31.65億bp組成含3~3.5萬基因與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因占2%人類基因組人類蛋白質(zhì)61%與果蠅同源43%與線蟲同源46%與酵母同源現(xiàn)在是7頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/317基因組學(xué)（genomics）：是闡明整個(gè)基因的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及基因之間相互作用的科學(xué)。功能基因組學(xué)（functionalgenomics）：是研究所有基因的功能的科學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）：是在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及其活動規(guī)律的科學(xué)。現(xiàn)在是8頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/318現(xiàn)在是9頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/319第一節(jié)基因組學(xué)基因組（genome）：是細(xì)胞或生物體中一套完整的遺傳物質(zhì)（真核生物包括核基因組及線粒體基因組兩部分）?；颍╣ene）：是基因組中一個(gè)功能性遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列。現(xiàn)在是10頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3110遺傳圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜0.7cM或kb

序列圖譜物理圖譜100kbSTSmap四張圖：物理圖、轉(zhuǎn)錄圖遺傳圖、序列圖

四、HGP的主要任務(wù)現(xiàn)在是11頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3111基因組（genome）一詞是由HWinkler于1920年提出來的，表示一個(gè)生物種配子中染色體的總和?，F(xiàn)在基因組一詞更常指細(xì)胞或生物體的全套遺傳物質(zhì)?；蚪M學(xué)（genomics）是由美國人Roderick在1986年提出并與《Genomics》一起問世?，F(xiàn)在是12頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3112人類基因組計(jì)劃的科學(xué)意義確定人類基因組所攜帶的全部遺傳信息，認(rèn)識自我，從而揭開人類生長發(fā)育的奧秘，追求健康，戰(zhàn)勝疾病。主要基因組計(jì)劃的基本情況：到目前為止，已經(jīng)完成了酵母、線蟲、果蠅、擬南芥、人類和水稻等真核生物基因組及數(shù)十個(gè)原核生物基因組?，F(xiàn)在是13頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3113現(xiàn)在是14頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3114一、人類基因組計(jì)劃的主要研究內(nèi)容（一）遺傳圖譜（geneticmap）：利用人類基因組中的一些特殊位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)志而進(jìn)行的基因組分區(qū)。又稱連鎖圖譜(linkagemap)，它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具有一個(gè)以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%）的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖?，F(xiàn)在是15頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3115遺傳圖采用遺傳學(xué)距離(geneticdistance)作為圖距，單位cM。cM值越大，兩者之間距離越遠(yuǎn)。人類基因組的遺傳大小已經(jīng)確定為3600cM。通過遺傳圖分析，可以了解各個(gè)基因或DNA片段之間的相對距離。遺傳標(biāo)志：1、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)2、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)3、單核苷酸多態(tài)性(SNP)現(xiàn)在是16頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31161、形態(tài)學(xué)標(biāo)記形態(tài)學(xué)標(biāo)記(morphologicalmarker)

能夠用肉眼識別和觀察、明確顯示遺傳多樣性的外觀性狀。特點(diǎn)

簡單直觀，但標(biāo)記數(shù)目少，多態(tài)性低，易受外界條件的影響；依據(jù)它進(jìn)行選擇的準(zhǔn)確性差，所需時(shí)間較長，選擇效率也較低?，F(xiàn)在是17頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31172、細(xì)胞遺傳標(biāo)記細(xì)胞遺傳標(biāo)記(cytologicalgeneticmarker)主要是指染色體核型（染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等）、帶型（Q、G、C、R帶型）和數(shù)量特征的變異等，它們分別反映了染色體在結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性?，F(xiàn)在是18頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3118家豬X、Y染色體G帶示意圖現(xiàn)在是19頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3119細(xì)胞遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)不受環(huán)境影響，呈孟德爾方式遺傳。多態(tài)性集中表現(xiàn)在染色體高度重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)的異染色質(zhì)所在的部位。細(xì)胞遺傳標(biāo)記經(jīng)常伴有對生物有害的表型效應(yīng)，難以獲得相應(yīng)的標(biāo)記材料，或者觀測和鑒定比較困難，從而限制了細(xì)胞遺傳標(biāo)記的應(yīng)用?，F(xiàn)在是20頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31203、生化與免疫遺傳標(biāo)記免疫遺傳學(xué)標(biāo)記(immunogeneticalmarker)以動物的免疫學(xué)特性為標(biāo)記，包括紅細(xì)胞抗原多態(tài)性和白細(xì)胞抗原多態(tài)性。生化遺傳標(biāo)記(biochemicalgeneticmarker)主要是指在同一動物個(gè)體中具有相同功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體?，F(xiàn)在是21頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3121同工酶與等位酶同工酶(isozyme)：電泳所可區(qū)分的同一種酶（系統(tǒng)）的不同變化等位酶(allozyme)：由一個(gè)位點(diǎn)的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同現(xiàn)在是22頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3122等位酶分析的過程材料的采集研磨和酶的提取酶的保存淀粉凝膠制備電泳凝膠切片酶的組織化學(xué)染色酶譜的記錄與分析數(shù)據(jù)分析現(xiàn)在是23頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3123生化與免疫遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)與形態(tài)學(xué)標(biāo)識和細(xì)胞遺傳標(biāo)記相比，數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響更小，檢測手段簡便，是一種較好的遺傳標(biāo)記。血液型和細(xì)胞質(zhì)型都是基因表達(dá)的產(chǎn)物，局限于反映基因組編碼區(qū)的遺傳信息，且標(biāo)記的數(shù)量還比較有限，不能很好地覆蓋整個(gè)基因組?，F(xiàn)在是24頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31244、分子遺傳標(biāo)記分子遺傳標(biāo)記(moleculargeneticmarker)是一種新的以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記.隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相繼建立了RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多種分子遺傳標(biāo)記檢測技術(shù)，開創(chuàng)了遺傳標(biāo)記研究的新階段。現(xiàn)在是25頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3125分子遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)無表型效應(yīng)不受環(huán)境的限制和影響普遍存在于所有生物數(shù)量豐富等特殊優(yōu)勢現(xiàn)在是26頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31265、理想的分子遺傳標(biāo)記應(yīng)具備的特點(diǎn)遺傳多態(tài)性高;檢測手段簡單快捷，易于實(shí)現(xiàn)自動化;遺傳共顯性，即在分離群中能夠分離出等位基因的3種基因型。標(biāo)記遍布整個(gè)基因組；準(zhǔn)確性，能正確反映動物的真實(shí)遺傳，即標(biāo)記是經(jīng)濟(jì)性狀基因，還是與影響重要性的性狀連鎖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好（便于數(shù)據(jù)交換）；開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；

現(xiàn)在是27頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3127二、分子遺傳標(biāo)記1、RFLP：限制性片段長度多態(tài)性2、TRS：串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記3、SNP：單核苷酸多態(tài)性現(xiàn)在是28頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31281、限制性片段長度多態(tài)性RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism最早應(yīng)用于動植物遺傳學(xué)研究的分子標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)在是29頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3129RFLP的原理利用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，形成大小不等、數(shù)量不同的分子片段，經(jīng)電泳分離，通過Southern印跡將DNA片段轉(zhuǎn)移至支持膜(尼龍膜或硝酸纖維素膜)上，然后用放射性同位素(32P)或非同位素(如地高辛，熒光素)標(biāo)記的探針與支持膜上的DNA片段進(jìn)行雜交。不同基因組DNA酶切位點(diǎn)的改變，會使得RFLP譜帶表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性.現(xiàn)在是30頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3130限制性酶切長度多態(tài)性(RFLP)現(xiàn)在是31頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3131限制性內(nèi)切酶的酶切原理：現(xiàn)在是32頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3132DNA分子上多態(tài)性位點(diǎn)在等位基因中存在與否是不同的?，F(xiàn)在是33頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3133RFLP的特征RFLP是第一種被用于作圖研究的DNA標(biāo)記，它們一般有如下特征：1）處于染色體上的位置相對固定；2）同一親本及其子代相同位點(diǎn)上的多態(tài)性片段特征不變；3）同一凝膠電泳可顯示不同多態(tài)性片段，具有共顯性特點(diǎn)?，F(xiàn)在是34頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3134PCR－RFLP將PCR技術(shù)用于RFLP分析，即PCR-RFLP。該技術(shù)先用1對引物特異性擴(kuò)增基因組的某一高變區(qū)，然后用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，電泳檢測多態(tài)性。PCR-RFLP分析省去了探針的制備、分子雜交等繁瑣的過程，DNA需求量也少，大大簡化了傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)?，F(xiàn)在是35頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3135PCR－RFLP的應(yīng)用??????CCTGAGGAG????????????CCTGTGGAG????????????CCTGAGGAG????????????CCTGAGGAG????????????CCTGTGGAG????????????CCTGTGGAG??????√MstⅡ酶切位點(diǎn)×MstⅡ酶切位點(diǎn)消失PCR-RFLPProValGluProGluGlu123正常雜合異?，F(xiàn)在是36頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3136檢測不同個(gè)體RFLP的技術(shù)

Southern印跡雜交（Southernblothybridization）

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR（Polymerasechainreaction）現(xiàn)在是37頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3137Southernblot現(xiàn)在是38頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3138PCR（Polymerasechainreaction）

現(xiàn)在是39頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3139現(xiàn)在是40頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3140現(xiàn)在是41頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3141短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)現(xiàn)在是42頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3142小衛(wèi)星序列（minisatellite），有時(shí)又稱可變串連重復(fù)（variablenumberoftandemrepeats,VNTR-），其重復(fù)單位的長度為數(shù)十個(gè)核苷酸。微衛(wèi)星序列（microsatellite）或簡單串聯(lián)重復(fù)（simpletandemrepeats,STRorSSR），其重復(fù)單位為1-6個(gè)核苷酸，由10-50個(gè)重復(fù)單位串聯(lián)組成。有二種類型的SSLP常用于作圖現(xiàn)在是43頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3143DNA指紋圖譜原理①選擇在VNTR特異序列上沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶將動物總基因組DNA切成不同長度的片段②以VNTR中特異序列作為探針，進(jìn)行Southern雜交，③由于不同個(gè)體的串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目和位置不同，形成的雜交譜帶具有個(gè)體的特異性，人們稱為DNA指紋圖譜(DNAfingerprinting,DFP)現(xiàn)在是44頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3144VNTR示意圖123A

B

C123VNTR變異的原理示意圖現(xiàn)在是45頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3145現(xiàn)在是46頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3146DFP的特點(diǎn)多態(tài)性檢測率高，位點(diǎn)呈共顯性遺傳個(gè)體具有高度特異性技術(shù)復(fù)雜、成本高，有時(shí)譜帶過于復(fù)雜現(xiàn)在是47頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3147⑵微衛(wèi)星（microsatelliteDNA,MS)又稱簡單序列重復(fù)(simplesequencerepeat,SSR)是高度重復(fù)序列，廣泛存在于真核生物基因組，重復(fù)單位的核心序列為2~6bp?，F(xiàn)在是48頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3148微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的原理以微衛(wèi)星DNA標(biāo)記兩側(cè)特異性序列設(shè)計(jì)專一引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，不同個(gè)體間因核心序列的重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性?，F(xiàn)在是49頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3149微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記示意圖ABPCR擴(kuò)增凝膠電泳123

AAAB

BB現(xiàn)在是50頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3150SNP標(biāo)記的特點(diǎn)⑴高密度

SNP是基因組中最普遍、頻率最高的遺傳標(biāo)記。單個(gè)SNP雖然只有兩個(gè)等位基因，多態(tài)信息含量不如微衛(wèi)星位點(diǎn)，但其高密度彌補(bǔ)了其不足?，F(xiàn)在是51頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3151單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）

現(xiàn)在是52頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3152SNP標(biāo)記的特點(diǎn)⑴高密度

SNP是基因組中最普遍、頻率最高的遺傳標(biāo)記。單個(gè)SNP雖然只有兩個(gè)等位基因，多態(tài)信息含量不如微衛(wèi)星位點(diǎn)，但其高密度彌補(bǔ)了其不足?，F(xiàn)在是53頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3153⑵代表性

某些位于基因表達(dá)序列內(nèi)的SNP(codingSNP,cSNP)，有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，鑒別cSNP對于復(fù)雜表型性狀與基因變異之間的關(guān)聯(lián)分析具有重要意義?，F(xiàn)在是54頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3154⑶易實(shí)現(xiàn)自動化分析

雙等位標(biāo)記，檢測時(shí)只需“有或無”表示。DNA芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)了SNP分析的高通量、微型化和自動化。現(xiàn)在是55頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3155檢測SNP的特異雜交

現(xiàn)在是56頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3156DNA芯片（DNAchip）技術(shù)

現(xiàn)在是57頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3157DNA芯片

現(xiàn)在是58頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3158動態(tài)等位專一性雜交（Dynamicallele-specifichybridization,DASH）

反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，樣品置于96孔板的每個(gè)凹槽中，由于熒光標(biāo)記試劑只與雙鏈DNA結(jié)合，所以只有可雜交的分子發(fā)出熒光。實(shí)驗(yàn)初始時(shí)保持可使單個(gè)堿基錯配的反應(yīng)條件，此時(shí)寡聚核苷酸可與任何等位SNP分子雜交。隨后逐步提高反應(yīng)溫度，由于完全互補(bǔ)配對的雜交分子較之含有錯配鹼基的雜交分子可耐受較高的溫度，因此當(dāng)反應(yīng)溫度升高到臨界點(diǎn)時(shí)，含有錯配的雜交分子將會解鏈，熒光信號同時(shí)消失，說明該樣品中含有SNP現(xiàn)在是59頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3159“遺傳圖”的建立為人類疾病相關(guān)基因的分離克隆奠定了基礎(chǔ)。擁有5000多個(gè)遺傳學(xué)位點(diǎn)，相當(dāng)于把整個(gè)人類基因組劃分為5000多個(gè)小區(qū)，并分別設(shè)置了“標(biāo)牌”。這些標(biāo)牌將在搜索功能基因的過程中發(fā)揮獨(dú)特的作用。現(xiàn)在是60頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3160把多態(tài)性的疾病基因位點(diǎn)（該位點(diǎn)至少包括“正?！奔啊爸虏　眱蓚€(gè)等位基因）與上述遺傳標(biāo)記進(jìn)行分析比較時(shí)，如果在家系中證實(shí)該基因與某個(gè)標(biāo)記不連鎖（重組率為50%），表明該基因不在這一標(biāo)記附近?，F(xiàn)在是61頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3161如果發(fā)現(xiàn)該基因與某個(gè)標(biāo)記有一定程度的“連鎖”（重組率小于50%但大于0），表明它可能位于這個(gè)標(biāo)記附近；如果該基因與某標(biāo)記間不發(fā)生重組（重組率等于0），我們就推測該標(biāo)記與所研究的疾病基因可能非常接近?，F(xiàn)在是62頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3162其它的DNA標(biāo)記（分子標(biāo)記）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism

即擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性）STS（序列位點(diǎn)標(biāo)簽）是由一段長度為２００～５００ｂｐ的序列所界定的位點(diǎn)，在基因組中只出現(xiàn)一次RAPD（RandomAmplfiedPolymorphicDNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性ＤＮＡ）現(xiàn)在是63頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3163遺傳作圖的方法孟德爾遺傳學(xué)簡介現(xiàn)在是64頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3164連鎖分析現(xiàn)在是65頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3165人類系譜分析的例子現(xiàn)在是66頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3166酵母3號染色體遺傳圖與物理圖比較現(xiàn)在是67頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3167（二）物理圖譜：人類基因組的物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段(序列標(biāo)簽位點(diǎn)，sequence-taggedsite,STS)為“路標(biāo)”，以堿基對(bp，kb，Mb)作為基本測量單位(圖距)的基因組圖?，F(xiàn)在是68頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3168物理作圖常用的方法1、熒光原位雜交圖

2、限制性酶切圖3、輻射雜交細(xì)胞圖4、連續(xù)克隆系圖現(xiàn)在是69頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3169用不同顏色標(biāo)記的各種DNA序列（探針），與染色體上的互補(bǔ)序列雜交而不破壞染色體的整體形態(tài)，顯微鏡下觀察、辨認(rèn)熒光標(biāo)記在染色體上的定位而繪制的圖譜。1、熒光原位雜交圖（FISHMap）現(xiàn)在是70頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3170現(xiàn)在是71頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3171現(xiàn)在是72頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3172現(xiàn)在是73頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3173現(xiàn)在是74頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3174現(xiàn)在是75頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3175現(xiàn)在是76頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3176

2、限制性酶切圖：選用合適的限制性內(nèi)切酶對基因組DNA或部分基因組DNA進(jìn)行酶切，以獲得以酶切位點(diǎn)為標(biāo)記的物理圖。

現(xiàn)在是77頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3177現(xiàn)在是78頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3178DNA分子限制性作圖獲得理想大小的DNA片段對基因組的限制性作圖至關(guān)重要，其關(guān)鍵是選擇合適的限制酶識別位點(diǎn)鹼基數(shù)目

預(yù)計(jì)DNA片段平均長度（kb）

4

0.2546

48

6410

1000現(xiàn)在是79頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3179限制性酶切制圖的局限性1、限制位點(diǎn)多時(shí)，產(chǎn)生大量的片段，難以排序

2、無法區(qū)分大小相同的片段現(xiàn)在是80頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3180稀有切點(diǎn)限制圖繪制稀有切點(diǎn)限制酶系指該酶識別的堿基順序在基因組中只有很少數(shù)量，可產(chǎn)生較大的DNA片段。選用稀有切點(diǎn)限制酶時(shí)有幾點(diǎn)必須注意：1）一般而言，識別順序越長產(chǎn)生的片段越大。但是，當(dāng)識別位點(diǎn)中含有非特異順序時(shí)，由于隨機(jī)選擇的干擾，片段的長度比預(yù)期的小。2）識別位點(diǎn)的堿基組成影響限制性片段的大小。3）有些限制酶識別位點(diǎn)較長，4）基因組DNA的甲基化狀態(tài)?，F(xiàn)在是81頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31813、輻射雜交細(xì)胞圖：利用X－射線照射人細(xì)胞，使染色體隨機(jī)斷裂，然后與嚙齒動物細(xì)胞雜交克隆，人染色體片段被整合到嚙齒動物染色體上。兩個(gè)相鄰基因或標(biāo)記越近，越可能出現(xiàn)在同一個(gè)片段而進(jìn)入同一個(gè)雜交細(xì)胞。通過識別、定位技術(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可計(jì)算人DNA標(biāo)志的連鎖關(guān)系?，F(xiàn)在是82頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3182現(xiàn)在是83頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3183連續(xù)克隆系圖：是最重要的一種圖譜，以序列標(biāo)簽為標(biāo)志。序列標(biāo)簽：STS是基因組中任何單拷貝的長度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識別序列相關(guān)聯(lián)。序列標(biāo)簽的特點(diǎn)：1、長度為100～500bp的已知序列；2、在染色體上的位置明確；3、可用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增的單一拷貝?，F(xiàn)在是84頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3184大片段DNA的分離回收脈沖凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)

基本原理：將一個(gè)方向不斷變換的電場取代簡單的單一電場（單向電場），使電泳中受阻的DNA分子在電場改變時(shí)扭轉(zhuǎn)遷移方向，達(dá)到分離的目的?，F(xiàn)在是85頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3185常規(guī)或非常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳

現(xiàn)在是86頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3186收集用于STS作圖的DNA片段

現(xiàn)在是87頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3187兩個(gè)STS標(biāo)簽在基因組上靠得近，它們就會一直同時(shí)出現(xiàn)在DNA大片段上；兩個(gè)STS標(biāo)簽在基因組上相距較遠(yuǎn)，它們同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)DNA大片段上的幾率就會小得多。關(guān)鍵：得到5套以上包含相關(guān)染色體或整個(gè)基因組的DNA片段是建立STS物理圖的先決條件。然后，可以通過拼接而得STS物理圖?，F(xiàn)在是88頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3188將帶有STS的基因組或部分基因組DNA，隨機(jī)斷為一定大小的片段后克隆，用探針雜交檢測重建片段的位置?，F(xiàn)在是89頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3189四種指紋分析方法

現(xiàn)在是90頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3190大片段克隆載體酵母人工染色體（yeastartificialchromosomes,YAC）酵母人工染色體載體pYAC3物理圖現(xiàn)在是91頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3191外源DNA的克隆過程現(xiàn)在是92頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3192細(xì)菌人工染色體現(xiàn)在是93頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3193P1人工染色體現(xiàn)在是94頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3194序列圖譜以某一染色體DNA上所含的全部堿基序列繪制圖譜，包括：轉(zhuǎn)錄序列非轉(zhuǎn)錄序列是轉(zhuǎn)錄序列、非轉(zhuǎn)錄序列、調(diào)節(jié)序列及功能未知序列的總和?，F(xiàn)在是95頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3195DNA序列測定的意義DNA的序列測定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對DNA一級結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解?，F(xiàn)在是96頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3196DNA序列測定技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)在是97頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3197DNA測序的技術(shù)關(guān)鍵DNA分離純化技術(shù)的發(fā)展DNA合成的隨機(jī)終止或DNA的隨機(jī)斷裂電泳技術(shù)的發(fā)展和完善工具酶的發(fā)現(xiàn)探針及探針標(biāo)記現(xiàn)在是98頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3198DNA序列測定的方法Sanger的加減法Sanger的雙脫氧末端終止法Gilbert－Maxam的化學(xué)修飾法DNA序列的自動分析基因芯片技術(shù)(雜交測序)PCR測序現(xiàn)在是99頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/3199DNA序列測定加減法簡介1、加法測序：將測序DNA樣品分類四分，形成四個(gè)反應(yīng)體系。分別稱為加A、加C、加G和加T。即在反應(yīng)體系中加入dNTP時(shí)，加A體系中其它三種底物量相同，而dATP為過量。以被測DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行DNA的合成。因酶與模板的結(jié)合及合成過程為隨機(jī)的而A為過量，因此合成反應(yīng)終止在A?，F(xiàn)在是100頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31100ACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTGATGCAATGCAACGTGCAATGCAATGCAACGTGCATGCAATGCAATGCAATGCATGCAATGCA加A體系現(xiàn)在是101頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31101ACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTGCAATGCAACGTGCAAGTGCAATGCAACGTGTGCAATGCAACGTGCAATGTG加G體系現(xiàn)在是102頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31102TGCAATGCAACGTGCAAGGTGACACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCTGCAATGCAACTGCAATGCTGC加C體系現(xiàn)在是103頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31103ACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTTGCAATGCAACGTTGCAAT加T體系加AIIIIIII加GIIIIIII

加CIIIII加TIII

cagtggaacgtgcaacgtaacg現(xiàn)在是104頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31104DNA序列測定雙脫氧合成終止法原理：是在加減法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的測序方法，也是目前手工測序的主要方法。被測DNA分為四分，也稱作加A、加C、加G和加T體系，以被測DNA為模板，由DNA聚合酶合成新的DNA分子。在四個(gè)反應(yīng)體系中四種底物量相同，但額外增加ddNTP中的一種，反應(yīng)時(shí)，酶選擇底物是隨機(jī)的，因此反應(yīng)為隨機(jī)終止?，F(xiàn)在是105頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31105現(xiàn)在是106頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31106OH現(xiàn)在是107頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31107現(xiàn)在是108頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31108DNA序列測定模板：即被測DNA。有兩種DNA可以做為測序模板：純單鏈DNA或變性DNA雙鏈DNA現(xiàn)在是109頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31109DNA序列測定引物：與模板完全互補(bǔ)的15～29個(gè)核苷酸片段。DNA聚合酶：測序反應(yīng)中的常用DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I大片段測序酶：是一種經(jīng)過化學(xué)修飾的T4噬菌體DNA聚合酶，完全失去了3’→5’外切活性。TaqDNA聚合酶：用于PCR循環(huán)測序現(xiàn)在是110頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31110現(xiàn)在是111頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31111DNA序列測定Maxam－Gilbert化學(xué)降解法測序原理：利用特異的選擇性試劑，專一性的隨機(jī)斷裂DNA成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類，從而測出DNA的序列?，F(xiàn)在是112頁\一共有125頁\編輯于星期五2023/3/31112DNA序列測定選擇性試劑嘧啶選擇性試劑：肼(H2NNH2)，在堿性條件下，能作用于T/C，使DNA在該處產(chǎn)生無嘧啶而使磷酸二酯鍵不穩(wěn)定發(fā)生斷裂。在有鹽存在下，肼對T的選擇下降，此時(shí)肼主要對C發(fā)生消除反應(yīng)產(chǎn)生無嘧啶結(jié)構(gòu)，使磷酸二酯鍵斷裂。因此在肼的作用下，使DNA在T或C處斷