經(jīng)典液相色譜法2

經(jīng)典液相色譜法演示文稿1當前1頁，總共61頁。2（優(yōu)選）經(jīng)典液相色譜法當前2頁，總共61頁。

吸附過程是試樣中組分分子與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心的過程。圖10-1吸附色譜示意圖m.流動相a.吸附劑Xm.流動相中溶質(zhì)分子Ym.流動相分子Xa.被吸附的溶質(zhì)分子

當前3頁，總共61頁。這種吸附平衡過程可表示為吸附平衡常數(shù):

因為流動相的量很大，近似于常數(shù)，而且吸附只發(fā)生于吸附劑表面，所以，吸附平衡常數(shù)可寫成當前4頁，總共61頁。CS為溶質(zhì)在固定相表面的分析濃度，Cm為溶質(zhì)在流動相中的分析濃度

K與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)。當前5頁，總共61頁。K值小，說明該物質(zhì)的吸附能力弱，在固定相中滯留時間短，移動速率快，先流出色譜柱；若K值大，說明該物質(zhì)的吸附能力強，在固定相中滯留時間長，移動速率慢，后流出色譜柱。在一定條件下，不同組分因吸附系數(shù)的差異得以分離。

2．吸附等溫線

在一定溫度下，某一組分在固定相和流動相之間達到平衡時，以組分在固定相中的濃度Cs為縱坐標，以組分在流動相中的濃度Cm為橫坐標得到的曲線。

當前6頁，總共61頁。等溫線有三種類型：線性、凸形和凹形。通常在低濃度時，每種等溫線均呈線性，而高濃度時，等溫線則呈凸形（常見）或凹形。吸附等溫柱內(nèi)溶質(zhì)濃度分布柱內(nèi)溶質(zhì)濃度的分布曲線流出曲線保留時間與進樣量的關(guān)系當前7頁，總共61頁。二、吸附劑

1.對吸附劑的要求：

(1)表面積大，具有一定的吸附能力。

(2)不應(yīng)與流動相發(fā)生化學反應(yīng)。

(3)粒度要細，一般為150目左右。2.常用吸附劑有機類活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔樹脂等無機類

氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、硅藻土等（1）硅膠（SiO2·xH2O）當前8頁，總共61頁。結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心

游離羥基(I)

鍵合羥基(Ⅱ)

硅醚結(jié)構(gòu)(Ⅲ)

硅醚結(jié)構(gòu)(Ⅲ)沒有吸附活性。

當前9頁，總共61頁。由于硅膠具有弱酸性，能與堿起反應(yīng)，只適用于分離酸性和中性化合物。

堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)中性氧化鋁pH7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)（2）氧化鋁(3)聚酰胺

由酰胺聚合而成的高分子物質(zhì)。當前10頁，總共61頁。

酰胺基中的羰基與酚類、黃酮類、酚類中的羥基或羧基形成氫鍵；酰胺基中的氨基與醌類、硝基類中的醌基、硝基形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用。（4）大孔吸附樹脂

一種不含交換基團，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶劑。大孔樹脂可分為非極性和中等極性兩類，在水溶液中吸附力較強且有良好的吸附選擇性，而在有機溶劑中吸附能力較弱。當前11頁，總共61頁。硅膠含水量（%）氧化鋁含水量（%）活度級別051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ表10-1硅膠、氧化鋁的含水量與活度級別的關(guān)系2.吸附劑的吸附活性：

氧化鋁、硅膠的吸附力的大小,還與其含水量有較大的關(guān)系：當前12頁，總共61頁。

活度級數(shù)含水量活性吸附能力小少大強大多小弱

加熱除水，活性提高，吸附力加強（活化）吸水，活性下降，吸附力減弱。

三、色譜條件的選擇選擇色譜分離條件時，必須從吸附劑、被分離物質(zhì)、流動相(洗脫劑)三方面進行綜合考慮。

當前13頁，總共61頁。1.被分離物質(zhì)的極性被分離物質(zhì)的極性越大,被吸附劑吸附得越牢!常見的化合物極性大小順序:

烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<脂類<酮類<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸類被分離物質(zhì)的極性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

(1)基本母核相同,基團極性愈大,分子極性愈大。基本母核相同,極性基團數(shù)目愈多,分子極性愈大。(2)分子雙鍵多,吸附力↑。(3)空間排列,影響極性。例如羥基處于能形成分子內(nèi)氫鍵的位置時當前14頁，總共61頁。2.吸附劑的活性:

吸附劑的活性↑大，對被測組分的吸附能力↑強

物質(zhì)的極性吸附劑活性大小防吸附太牢,難洗脫小大防tR太小,不易分離3.流動相的極性

流動相極性大，對被測組分的洗脫能力強當前15頁，總共61頁。常用流動相極性強弱順序:

石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<醋酸乙酯<正丁醇<丙醇<乙醇、甲醇<水

被分離物質(zhì)的極性吸附劑活性流動相極性

大小大小大小

流動相可用一元,兩元或三元，也可采用梯度洗脫等技術(shù)。當前16頁，總共61頁。一、基本原理

將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體)表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差別而被分離。第2節(jié)液-液分配柱色譜法（LLC）當前17頁，總共61頁。

分配系數(shù)小的組分，移動速度快，先流出色譜柱；分配系數(shù)大的組分，移動速度慢，后流出色譜柱。二、載體載體（擔體）起支撐與分散固定液的作用要求：化學惰性，不吸附被分離組分，純凈，顆粒大小均勻。常用的載體有硅膠、纖維素、硅藻土等三、

固定液與流動相的選擇

固定液是機械吸附在惰性載體上的液體當前18頁，總共61頁。分配色譜根據(jù)固定液和流動相的相對極性，可以分為兩類：正相色譜和反相色譜

正相色譜反相色譜固定液極性大小流動相極性小大適于分離的物質(zhì)極性物質(zhì)中等極性至非極性的物質(zhì)流出順序極性小的組分先流出柱極性大的組分先流出在正相色譜法中，固定液有水、各種緩沖溶液、稀硫酸、甲醇、甲酰胺或丙二醇等強極性溶劑，以及它們的混合液.用極性較小的有機溶劑為洗脫劑進行洗脫分離。當前19頁，總共61頁。在反相分配色譜中，常以硅油、液體石蠟等極性較小的有機溶劑作為固定液，而以極性強的水、水溶液或與水混溶的有機溶劑為流動相。第3節(jié)離子交換色譜法（IEC）以離子交換樹脂為固定相的柱色譜法稱為離子交換柱色譜法。流動相為水溶液或各種緩沖溶液。用于離子或可離子化化合物的分離。一、分離原理當前20頁，總共61頁。

離子交換平衡常數(shù):

[A+]r、[B+]r分別表示樹脂中A、B離子的濃度;[A+]、[B+]分別表示水液中A、B離子的濃度若

KB/A>1,說明B+較牢地結(jié)合在樹脂上

KB/A<1,說明A+較牢地結(jié)合在樹脂上所以KB/A說明了樹脂對A+、

B+兩種離子選擇性交換的能力,故也稱之為選擇性系數(shù)。

當前21頁，總共61頁。

用離子交換樹脂分離不同離子時，樣品組分離子與流動相離子在樹脂上產(chǎn)生競爭交換，交換能力弱的離子易被流動相洗脫。選擇性系數(shù)大的離子交換能力強，保留時間長，后流出色譜柱。結(jié)果各種離子按選擇性系數(shù)的大小順序被洗脫。二、離子交換樹脂結(jié)構(gòu)與分類離子交換樹脂是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的高分子多元酸或多元堿的聚合物。常用的是聚苯乙烯型離子交換樹脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合而成球形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚苯乙烯型磺酸基陽離子交換樹脂的制備：當前22頁，總共61頁?；撬峄宦?lián)劑如果用其它基團代替磺酸基，就可以得到一系列陽離子交換樹脂。例如─COOH、─OH等。這些基團上的氫離子可被樣品溶液中的陽離子交換。

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

當前23頁，總共61頁。陰離子交換樹脂具有與陽離子交換樹脂同樣的有機骨架，只是在骨架上引入了可離解的堿性基團，如季胺基(─NR＋3OH－

)等，就成為陰離子交換樹脂。其交換反應(yīng)如下：

三、離子交換樹脂的性能1.交聯(lián)度:

交換樹脂中,交聯(lián)劑(二乙烯苯)的含量為交聯(lián)度,以重量百分比表示。當前24頁，總共61頁。

交聯(lián)度網(wǎng)眼交換速度離子選擇性大小慢小離子好小大快大小離子差陽離子交換樹脂一般交聯(lián)度8%

陰離子交換樹脂一般交聯(lián)度4%2.交換容量:

交換容量是指每克干樹脂能參加交換反應(yīng)的活性基團數(shù)。一般為1～10mmol/g。它反映了離子交換樹脂進行離子交換反應(yīng)的能力，決定于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)所含有的酸性或堿性基團的數(shù)目。樹脂的結(jié)構(gòu)與組成、溶液的pH等因素都影響交換容量。當前25頁，總共61頁。第4節(jié)空間排阻柱色譜法（SEC）利用被測組分分子大小不同，在固定相上選擇性滲透，實現(xiàn)分離。主要用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等的分離。

固定相→多孔性凝膠流動相→水——凝膠過濾色譜流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜

一、基本原理1．分子篩效應(yīng)當前26頁，總共61頁。體積大的組分完全不能進入凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中，只能經(jīng)過凝膠顆粒之間的間隙隨流動相最先流出色譜柱；而體積小的組分，可滲入凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中，因此在流經(jīng)凝膠顆粒之間的間隙和全部凝膠顆粒的孔隙之后，最后流出；介于大小分子中間的組分，只能進入一部分顆粒內(nèi)較大的孔隙，在中間時間段流出。根據(jù)溶質(zhì)分子大小的不同進行分離的現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)2．滲透系數(shù)KP

當前27頁，總共61頁。Xm與Xs分別代表在孔外流動相中和凝膠孔隙中同等大小的溶質(zhì)分子。平衡時，兩者濃度之比為滲透系數(shù)根據(jù)空間排阻理論，凝膠孔內(nèi)外同等大小的分子處于擴散平衡狀態(tài)Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動相的性質(zhì)無關(guān)當前28頁，總共61頁。在凝膠孔徑一定時，當分子大到不能進入凝膠所有空隙時（排斥極限），

[XS]=0，則KP=0；而當分子小到能進入所有空隙時（全滲透），[XS]=[Xm]，KP=1；分子尺寸在上述兩種分子之間時，能進入部分空隙，

0＜KP＜1.在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小與分子量成比例，因此，在一定范圍內(nèi)，KP與分子量相關(guān)，分子量小，KP大。當前29頁，總共61頁。排斥極限與全滲透之間對應(yīng)的分子量范圍稱為凝膠的分子量范圍。選擇凝膠時應(yīng)使試樣的分子量落入此范圍。當組分的分子量在凝膠的分子量范圍之內(nèi)時，其保留體積與滲透系數(shù)有如下關(guān)系:VS為凝膠孔隙的總體積（固定相體積），Vm為凝膠的粒間體積（流動相體積）二、固定相和流動相當前30頁，總共61頁。固定相常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和.聚苯乙烯凝膠等。

要選擇對樣品的溶解好，又能潤濕凝膠，粘度要低的溶劑，否則，會限制分子擴散而影響分離效果。一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性試樣選四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機溶劑。流動相第5節(jié)薄層色譜法（TLC）當前31頁，總共61頁。

將固定相均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進行色譜分離分析的方法稱為薄層色譜法（TLC）。鋪有固定相的板子稱為薄層板簡稱薄板。在薄層色譜法中使用的流動相又稱為展開劑。

按分離機制薄層色譜法可分為吸附、離子交換、分配和分子排阻色譜法等。按薄層板的分離效率不同，又可分為經(jīng)典薄層色譜法(TLC)及高效薄層色譜法(HPTLC)。本節(jié)主要討論應(yīng)用最為廣泛的吸附薄層色譜法。操作過程：當前32頁，總共61頁。特點：設(shè)備簡單，操作方便，分析速度快，分離效率高，靈敏度高，顯色方便，結(jié)果直觀，預(yù)處理簡單。應(yīng)用：定性、藥物雜質(zhì)檢查、純度測定一、基本原理1.分離過程將混合組分的試液,點在鋪了吸附劑的玻璃板一端,在密閉容器中用適當?shù)娜軇?展開劑、流動相)展開,各組分不斷地被吸附,解吸附…

隨展開劑前移,利用吸附劑對不同組分的吸附能力(吸附平衡常數(shù))不同,產(chǎn)生差速遷移,而達到分離。當前33頁，總共61頁。2.比移值RfA=a/cRfB=b/c一般要求組分的

值在0.2～0.8之間。Rf=0，被固定完全吸附,K

Rf=1，組分不被固定相吸附,K0)0Rf1當前34頁，總共61頁。

比移值是薄層色譜的基本定性參數(shù)，它說明組分在色譜系統(tǒng)中的保留行為。比移值的數(shù)值除與組分的性質(zhì)有關(guān)外，還與薄層板的性質(zhì)(活性等)、展開劑的性質(zhì)(極性、組成等)和溫度有關(guān)。影響Rf值的因素很多，測量重復性較差

3．相對比移值在一定條件下，吸附平衡常數(shù)越大，容量因子k就越大，則比移值越小。當前35頁，總共61頁。討論對照品與被測組分在完全相同條件下展開，可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；對照品可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分。相對比移值Rst與組分、對照品性質(zhì)等因素有關(guān)，可以大于或小于1。AB對cab當前36頁，總共61頁。二、固定相吸附柱色譜的固定相薄層色譜也可以使用,如硅膠、Al2O3等，但粒度比柱色譜更細。硅膠微帶酸性，適用于酸性及中性物質(zhì)的分離。薄層色譜用硅膠粒度為～40μm，硅膠G硅膠+煅石膏（CaSO4）硅膠H硅膠(未加任何物質(zhì))硅膠HF254硅膠+熒光物質(zhì)硅膠GF254硅膠+煅石膏+熒光物質(zhì)氧化鋁一般適用于堿性物質(zhì)和中性物質(zhì)的分離當前37頁，總共61頁。三、展開劑在吸附薄層色譜法中，展開劑選擇的一般原則與吸附柱色譜法中選擇流動相的原則相同，主要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性以及展開劑本身的極性來選則。當前38頁，總共61頁。

實驗中，一般先選擇單一溶劑展開，對難分離組分，則需使用二元、三元甚至多元的溶劑系統(tǒng)。

在多元展開劑中占比例較大的主要溶劑起溶解樣品和基本分離的作用，占比例較小的溶劑起調(diào)整Rf

值、改善分離度和對某些組分的選擇性作用。

如某一物質(zhì)在用苯作展開劑時，移動距離太小，說明展開劑的極性太小，此時可以加入一定量的乙醇等極性大的溶劑。再視分離的效果適當改變?nèi)軇┑呐浔?，如?乙醇為9︰1、8︰2或7︰3等。必要時甚至還要加一些酸或堿。一般希望Rf值在0.2~0.8之間較為滿意。當前39頁，總共61頁。四、操作方法1.薄層板制備

薄層板分為硬板與軟板。軟板的制備是直接將吸附劑置于玻璃板上并使成為一均勻薄層便制成了一塊軟板。硬板的制備需要以下幾個步驟：①載板的準備。②勻漿的制備：制備勻漿時有時需要加一些粘合劑，常用粘合劑有煅石膏、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）等。當前40頁，總共61頁。煅石膏：吸附劑的9-15%左右羧甲基纖維素鈉CMC-Na：0.5-1%水溶液

例如，取一定量的硅膠H放入研缽中，加入3倍量的含有0.3%～0.7%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的水溶液，朝同一方向研磨成均勻稀糊狀.③鋪板

手工涂鋪法

機械涂鋪法

當前41頁，總共61頁。④活化：將鋪好的薄層板先涼干，再在105～110℃進行加熱活化，活化的程度等要根據(jù)樣品的性質(zhì)決定。2.點樣（1）樣品溶液的制備

應(yīng)盡量避免用水作溶劑，因為水溶液斑點容易擴散，且不易揮發(fā)。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發(fā)性有機溶劑，最好用與展開劑極性相似的溶劑。水溶性樣品可先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。

當前42頁，總共61頁。（2）點樣量

點樣量的多少視薄層的性能及顯色劑的靈敏度等而定，在檢測器靈敏度足夠時，應(yīng)降低點樣量。點樣量太多，展開后會出現(xiàn)斑點過大或拖尾等現(xiàn)象，而影響分離效果。點樣體積一般在幾到幾十微克（1～10l）,

點樣量太大,斑易拖尾,影響分離效果。(3)點樣方法點樣方式：接觸式點樣與噴霧式點樣點樣形狀；點狀、條狀點樣點樣器具微量進樣器、定量毛細管；底距：1.5～2cm點距：0.5～1cm原點直徑：2～3mm。（邊點邊熱風吹）當前43頁，總共61頁。當前44頁，總共61頁。起始線當前45頁，總共61頁。3.展開將點好樣的薄層板浸入展開劑中，展開劑借薄層板上固定相的毛細作用攜帶樣品組分在薄層板上遷移一定距離的過程稱為展開。（1）展開裝置常用的展開裝置有直立型的單槽色譜缸和雙槽色譜缸、圓形色譜缸、臥式色譜缸等。當前46頁，總共61頁。(2)展開方式

一般展開方式：上行、下行、雙向等展開距離：6～15cm注意點：①展開劑浸薄層板下端0.5cm,不能浸住起始線,層析缸應(yīng)密閉。②先飽和15～30分鐘,再展開,防止邊緣效應(yīng)。

當前47頁，總共61頁。

邊緣效應(yīng)是指同一物質(zhì)的色譜斑點，在薄層板上兩邊緣部分的Rf值大于中間部分的Rf值的現(xiàn)象。

這是由于色譜缸內(nèi)溶劑蒸氣未達飽和，造成展開劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩邊與中間部分不等。展開劑中極性較弱和沸點較低的溶劑在邊緣揮發(fā)的快些，致使邊緣部分的展開劑中極性溶劑比例增大，故Rf值相對變大。

當前48頁，總共61頁。原點12雙向展開4.斑點定位有色化合物——直接定位當前49頁，總共61頁。無色化合物紫外燈下檢出熒光板上有暗斑顯色劑定位噴霧或浸漬顯色蒸氣顯色顯色劑有通用型和專用型兩種。通用型顯色劑有碘、硫酸溶液、等。碘使許多化合物顯色，如生物堿、氨基酸衍生物、肽類、脂類及皂甙等。它的最大特點是與物質(zhì)的反應(yīng)是可逆的，當?shù)馍A揮去后，斑點便于進一步處理。硫酸能對大部分有機化合物顯色，但它是破壞性顯色劑。斑點有熒光物理撿出法化學撿出法當前50頁，總共61頁。

專用顯色劑是指對某個或某一類化合物顯色的試劑，例如茚三酮是氨基酸的專用顯色劑，。羧酸可用酸堿指示劑作顯色劑，含酚羥基物質(zhì)可噴三氯化鐵—鐵氰化鉀試劑進行顯色。

顯色劑直接由噴霧器噴灑在硬板上，立即顯色或加熱至一定溫度顯色。五、定性分析1.利用Rf值定性或相對比移值Rst（在同一塊板上）2.Rf值+斑點顏色特征（原位化學反應(yīng)）;3.多種展開劑體系展開進行驗證;4.與其他技術(shù)聯(lián)用。當前51頁，總共61頁。六、定量分析（一）洗脫法薄層分離——取下斑點——洗脫——離心——取上清液進行測定（二）薄層掃描法又稱原位定量薄層掃描法1.基本原理當前52頁，總共61頁。

用一束一定波長、一定強度的紫外或可見光對薄層板進行掃描，測定薄層板上的樣品斑點對光的吸收強度或斑點經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強度，所得關(guān)系曲線下的面積與色譜斑點中待測物質(zhì)的濃度或量成正比。薄層掃描法的