色譜法的基本原理

色譜法的基本原理演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共35頁(yè)。（優(yōu)選）色譜法的基本原理當(dāng)前2頁(yè)，總共35頁(yè)。2.1

概述2.1.1

色譜法發(fā)展史色譜法是俄國(guó)植物學(xué)家Tswett（茨維特）于1903年首先提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根裝有固體碳酸鈣顆粒（固定相）的豎直玻璃管（色譜柱）中，并再?gòu)墓艿纳喜考尤爰兊氖兔眩鲃?dòng)相），任其自由流下。這時(shí)植物色素的抽提液沿玻璃管流動(dòng)，在管內(nèi)形成具有不同顏色的色帶，每個(gè)色帶代表不同的組分。

--------“色譜”（色層）因而得名當(dāng)前3頁(yè)，總共35頁(yè)。胡蘿卜素（橙色）植物色素葉綠素（綠色）葉黃素（黃色）石油醚CaCO3固定相1941年，Martin、Syuge發(fā)明了液－液色譜。1952年，James、Martin發(fā)明了氣相色譜。20世紀(jì)60年代，出現(xiàn)了高效液相色譜。當(dāng)前4頁(yè)，總共35頁(yè)。⑴色譜法：借助在兩相間分配系數(shù)的差異，而使混合物中各組分獲得分離的技術(shù)稱為色譜分離技術(shù)。⑵固定相：填充柱內(nèi)的填料（固體或液體）。⑶流動(dòng)相：攜帶樣品流過固定相(氣體、液體和超臨界流體)。⑷色譜柱：裝有固定相的柱。色譜分離過程：當(dāng)流動(dòng)相中攜帶混合物經(jīng)過固定相時(shí)，與固定相發(fā)生作用，由于各組分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)（溶解度、極性、蒸汽壓和吸附能力等）不同，這種相互作用產(chǎn)生強(qiáng)弱的差異。在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，按先后不同的次序從固定相中流出。幾個(gè)基本術(shù)語(yǔ)：當(dāng)前5頁(yè)，總共35頁(yè)。

氣相色譜

--------用氣體作流動(dòng)相

液相色譜

--------用液體作流動(dòng)相由于固定相可分為固體吸附劑和涂在固體擔(dān)體上或毛細(xì)管內(nèi)壁上的液體固定相，故可將色譜法分為下述四類：

氣–固色譜氣體固體

流動(dòng)相固定相

液體液體

1、按兩相所處的狀態(tài)分類液-固色譜氣-液色譜液–液色譜2.1.2色譜法分類當(dāng)前6頁(yè)，總共35頁(yè)。①柱色譜：固定相裝在柱管內(nèi)。它又可分為填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。固定相裝在色譜柱（玻璃管或毛細(xì)管）內(nèi)。②紙色譜：用濾紙作固定相或載體，把試樣液體滴在濾紙上，用溶劑將它展開，根據(jù)其在紙上有色斑點(diǎn)的位置與大小，進(jìn)行鑒定與定量測(cè)定。③薄層色譜：將固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。樣品的分離形式類似紙色譜。2、按固定相形狀分類當(dāng)前7頁(yè)，總共35頁(yè)。當(dāng)前8頁(yè)，總共35頁(yè)。①

吸附色譜（L-S，G-S）：利用吸附劑對(duì)不同組分物理吸附性能的差異進(jìn)行分離。

②

分配色譜（L-L，G-L）：利用不同組分在兩相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。在液-液分配色譜中，根據(jù)流動(dòng)相和固定相相對(duì)極性不同，又分為正相分配色譜和反向分配色譜。③

離子交換色譜（L-S）：利用組分離子與離子交換劑的交換能力不同進(jìn)行分離。④

空間排阻色譜（凝膠色譜法，L-S）：用多孔物質(zhì)對(duì)不同大小分子的阻礙作用進(jìn)行分離。固定相是一種分子篩或凝膠，利用各組分的分子體積大小不同而進(jìn)行分離的方法。⑤親和色譜：利用不同組分與固定相的高專屬性親合力(生物分子之間特異的結(jié)合能力例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體等)進(jìn)行分離的技術(shù)，常用于蛋白質(zhì)的分離。3、按分離過程的物理化學(xué)原理分類當(dāng)前9頁(yè)，總共35頁(yè)。色譜法的分類大致如下：

根據(jù)以上所述，將色譜法的分類總結(jié)于下表中：當(dāng)前10頁(yè)，總共35頁(yè)。2.2色譜分離原理2.2.1分配系數(shù)和分配比分配系數(shù)：分配比k（又稱容量因子）定義：在一定的溫度、壓力下，組分在氣–液兩相間達(dá)平衡時(shí)，分配在液相中的重量與分配在氣相中的重量之比。即s：固定相m：流動(dòng)相k

隨柱溫、柱壓、相體積變化，由組分及固定液的熱力學(xué)性質(zhì)決定β：相比當(dāng)前11頁(yè)，總共35頁(yè)。進(jìn)樣A＋B＋空氣BAA+B流動(dòng)相BBA流動(dòng)相固定相檢測(cè)和紀(jì)錄2.2.2分離原理當(dāng)前12頁(yè)，總共35頁(yè)。2.3色譜流出曲線色譜流出曲線（色譜圖）即色譜柱流出物通過檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。峰高←色譜峰保留時(shí)間（分）響應(yīng)值當(dāng)前13頁(yè)，總共35頁(yè)。當(dāng)前14頁(yè)，總共35頁(yè)。1、有關(guān)術(shù)語(yǔ)①

基線：柱中僅有流動(dòng)相通過時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖中O-t線。穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。②峰高：色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，h③標(biāo)準(zhǔn)偏差④峰面積A⑤半峰寬Y1/2

=2.354⑥

峰底寬Y=4、Y1/2

、Y：區(qū)域?qū)挾犬?dāng)前15頁(yè)，總共35頁(yè)。死時(shí)間tm:

不被固定相吸附或溶解的組分進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需的時(shí)間。對(duì)于氣相色譜，常把空氣(TCD)和甲烷(FID)從進(jìn)樣到出峰的時(shí)間稱為tm。如圖中O-A’。這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，其流速與流動(dòng)相的流速接近。測(cè)定流動(dòng)相平均線速度ū時(shí)可用柱長(zhǎng)L與死時(shí)間tm

的比值計(jì)算。2、保留值當(dāng)前16頁(yè)，總共35頁(yè)。保留時(shí)間tR

試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)色譜峰極大值所需要時(shí)間。如圖中O-B。它相應(yīng)于樣品到達(dá)檢測(cè)器所需的時(shí)間。

tR=tR′+tm調(diào)整保留時(shí)間tR′

扣除死時(shí)間后的組份保留時(shí)間，即

tR′=tR

tm

組分在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組分隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留的時(shí)間；tR′實(shí)際上是組分在固定相中滯留的時(shí)間。單位(s)或(cm)。當(dāng)前17頁(yè)，總共35頁(yè)。死體積Vm

不能被固定相滯留的（惰性）組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值時(shí)所消耗的流動(dòng)相的體積。死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F0（L／min）計(jì)算：

Vm=tm·F0保留體積VR

從進(jìn)樣開始到柱后被測(cè)組份出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所通過的流動(dòng)相體積。如下：

VR=tR·F0當(dāng)前18頁(yè)，總共35頁(yè)。調(diào)整保留體積VR′

某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體積

VR′=tR′·F0

或VR′=VR-Vm相對(duì)保留值α2,1

某組份2與組份1的調(diào)整保留值之比，是一個(gè)無(wú)因次量。α2,1的大小與兩組分的選擇性有關(guān)。α2,1越大，選擇性越好，越容易分離。α2,1只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)。因此是色譜法中，特別是氣相色譜法中廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。當(dāng)前19頁(yè)，總共35頁(yè)。

從色譜流出曲線上，可以得到許多重要信息：①根據(jù)色譜峰個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個(gè)數(shù)。②根據(jù)色譜峰的保留值（或位置），可以進(jìn)行定性分析。③根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析。④色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)。⑤色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。當(dāng)前20頁(yè)，總共35頁(yè)。在自然科學(xué)上，科學(xué)理論：假設(shè)理論模型(數(shù)學(xué)表達(dá)式)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證修改模型完善1.塔板理論假設(shè)①在每塊塔板上氣液平衡是瞬間建立的。②載氣以脈沖式(塞子式)進(jìn)入色譜柱進(jìn)行沖洗，每次恰好為一個(gè)塔板體積。③所有組分開始都加在第零號(hào)塔板上，且不考慮沿色譜柱方向的縱向擴(kuò)散。④在所有塔板上同一組分的分配系數(shù)是常數(shù)，和組分的量無(wú)關(guān)。⑤柱分成幾段，n為理論塔板數(shù)，每段高為H，柱長(zhǎng)為L(zhǎng)，n=L/H。2.4塔板理論當(dāng)前21頁(yè)，總共35頁(yè)。當(dāng)前22頁(yè)，總共35頁(yè)。假定：K=1Vs/Vm=1k=1n=5進(jìn)樣量w=10.50.50.250.250.250.250.1250.250.1250.12550.250.1250.06250.1880.1880.06250.06250.1880.1880.06250.031250.1250.1880.1250.031250.031250.1250.1880.1250.03125w=1μg1ΔV2ΔV3ΔV4ΔV①分布有一最大，兩邊逐漸減?、谧畲蠹罢麄€(gè)分布曲線向后推移③流出曲線方程（塔板理論方程）在此檢測(cè)得到位移隨時(shí)間變化曲線當(dāng)前23頁(yè)，總共35頁(yè)。

這一理論得到結(jié)果：

1．分布有一最大，兩邊逐漸減??；

2．最大及整個(gè)分布曲線向后推移；

3．流出曲線方程(也稱塔板理論方程)，即數(shù)學(xué)表達(dá)式：C：不同流出體積時(shí)的組分濃度m：進(jìn)樣量VR：保留體積N：塔板數(shù)V

：流出體積SV(t,x)被測(cè)物流出色譜柱時(shí)流動(dòng)相中被測(cè)物濃度隨體積(或時(shí)間)的變化曲線：當(dāng)前24頁(yè)，總共35頁(yè)。在氣相色譜柱內(nèi)，理論塔板數(shù)一般達(dá)103～106。塔板數(shù)越多，其流出曲線越接近于正態(tài)分布。根據(jù)塔板理論可以導(dǎo)出N與色譜峰半寬度或峰底寬度的關(guān)系：理論塔板高度H：

色譜峰W越小，N越大，H越小，柱效能越高。因此，N和H是描述柱效能的指標(biāo)。在實(shí)際工作中，計(jì)算出來(lái)的N和H值時(shí),有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因?yàn)橛胻R計(jì)算時(shí)，沒有扣除死時(shí)間tm，應(yīng)予扣除。所以用tR′代替tR計(jì)算出來(lái)的N值稱為有效理論塔板數(shù)Neff。

當(dāng)前25頁(yè)，總共35頁(yè)。為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)色譜柱效能，宜采用有效塔板數(shù)Neff和有效塔板高度Heff。有效塔板數(shù)Neff和有效塔板高度Heff消除了死體積影響，較真實(shí)的反映了色譜柱的好壞。

有效塔板高度：根據(jù)tR′=tR-tm，k=

tR′/tm，tR=tm(1+k)，可得當(dāng)前26頁(yè)，總共35頁(yè)。⒉塔板理論的成功與局限⑴

成功①導(dǎo)出流出曲線數(shù)學(xué)表達(dá)式(模型)；②解釋了流出曲線形狀、濃度極大點(diǎn)；③提出了評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)(N)及其計(jì)算公式。⑵局限①僅考慮了熱力學(xué)因素，沒有考慮動(dòng)力學(xué)因素；②不能說(shuō)明影響柱效的原因及譜帶擴(kuò)張的原理；③不能說(shuō)明流速對(duì)柱效的影響，實(shí)驗(yàn)測(cè)得流速不同時(shí)N和H不同。速率理論當(dāng)前27頁(yè)，總共35頁(yè)。

2.5速率理論1956年荷蘭化學(xué)家VanDeemter等在研究氣-液色譜時(shí)，討論擴(kuò)散傳質(zhì)等與色譜過程物料平衡和質(zhì)量平衡的關(guān)系，考察溶質(zhì)通過色譜體系總濃度的變化。他提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論—速率理論。隨后Giddings吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，認(rèn)為把色譜過程看作分子無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)的隨機(jī)過程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。當(dāng)前28頁(yè)，總共35頁(yè)。該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。VanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡(jiǎn)化式為:式中：u為流動(dòng)相的線速度；A，B，C為常數(shù)A——渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)B——縱向分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)C——傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)（C

＝C

s＋C

m)。其中C

s：固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)；C

m：流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。當(dāng)前29頁(yè)，總共35頁(yè)。

A=2λdP

λ填充不規(guī)則因子

dP

填充物顆粒的平均直徑。影響A的因素：填充物顆粒大小dP和填充均勻性λ(取決于填充物顆粒的大小分布和裝柱情況）有關(guān),與載氣性質(zhì)、線速和組分無(wú)關(guān)。減小渦流擴(kuò)散提高柱效的有效途徑：使用適當(dāng)?shù)牧６惹翌w粒均勻的擔(dān)體，并盡量填充均勻。AB渦流擴(kuò)散項(xiàng)A當(dāng)前30頁(yè)，總共35頁(yè)。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u

B=2Dg

固定相填充在柱內(nèi)后使氣體擴(kuò)散路徑變彎曲的因素.Dg組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2/s）。填充柱γ=0.5-0.7毛細(xì)管柱γ=1.0分子量大的組分Dg小，Dg反比于載氣密度（分子量）的平方根,故采用分子量較大的載氣可使B項(xiàng)降低。保留時(shí)間長(zhǎng),分子擴(kuò)散項(xiàng)對(duì)色譜峰變寬的影響顯著.當(dāng)前31頁(yè)，總共35頁(yè)。Cgu

--氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)；Cg--氣相傳質(zhì)阻力系數(shù);Clu--液相傳質(zhì)阻力項(xiàng)；Cl--液相傳質(zhì)阻力系數(shù)傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu Cu=Cgu+Clu＝(Cg+Cl)u

氣相傳質(zhì)過程：氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)與填充物粒度的平方成正比，與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的氣體作載