第二章熒光分光度法

第二章熒光分光度法第一頁，共九十四頁，2022年，8月28日§2-1概述一、歷史二、基本概念三、熒光光譜分析法的特點(diǎn)重點(diǎn)是熒光光譜分析法生物分子分析的需要促進(jìn)了它的發(fā)展熒光分析法非常靈敏熒光測(cè)量在人類基因測(cè)序中起了重要作用第二頁，共九十四頁，2022年，8月28日§2-1概述一、歷史：16世紀(jì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)熒光，但沒有人能解釋該現(xiàn)象；1575年西班牙內(nèi)科醫(yī)生、植物學(xué)家第一次記錄熒光現(xiàn)象；1852年斯托克斯觀察奎寧、葉綠素?zé)晒?，解釋了熒光是由于物質(zhì)吸收了光能后發(fā)射出來的分子熒光。1864年，他建立了熒光分析手段。1965年以后，熒光光譜興趣激增，生物化學(xué)家利用它的高靈敏度；20世紀(jì)，人類基因組計(jì)劃的完成，熒光檢測(cè)技術(shù)功不可滅，如今，在生命科學(xué)研究中將發(fā)揮更大作用。第三頁，共九十四頁，2022年，8月28日§2-1概述分子選擇性吸收能量，電子由基態(tài)進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射光譜M+能量磷光P熒光FM*M+熱量M+hυ’+熱量壽命10-8~10-14s10-4~10s光子——光致發(fā)光M+hυ→M*陰極射線——陰極射線發(fā)光X射線——X射線發(fā)光熱——白熾發(fā)光超聲波——聲納發(fā)光離子流——離子發(fā)光化學(xué)反應(yīng)能——化學(xué)發(fā)光第四頁，共九十四頁，2022年，8月28日§2-1概述二、基本概念熒光是物質(zhì)分子吸收了較短波長的光（通常是紫外-可見光），在很短的時(shí)間內(nèi)（幾納秒至幾微秒）發(fā)射出較照射光波長為長的光。熒光光譜分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法。第五頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、熒光光譜分析法的特點(diǎn)1.靈敏度高熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)（提高激發(fā)光強(qiáng)度，可提高熒光強(qiáng)度）。

采用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)可大大提高靈敏度，熒光分析法的檢測(cè)限比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)激發(fā)發(fā)射熒光強(qiáng)強(qiáng)激發(fā)光物質(zhì)熒光10-7-10-9紫外10-4-10-7mg/mL第六頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、熒光光譜分析法的特點(diǎn)2.選擇性好不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測(cè)熒光波長比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好3.實(shí)驗(yàn)方法簡單4.待測(cè)樣品用量少5.儀器價(jià)格適中第七頁，共九十四頁，2022年，8月28日§2-2熒光光譜法一、熒光光譜基本原理二、熒光分析儀器三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜四、溶液熒光光譜的特征五、熒光物質(zhì)的必要條件六、影響物質(zhì)發(fā)光的因素七、定量分析方法八、熒光分析法的應(yīng)用第八頁，共九十四頁，2022年，8月28日具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子光照后，價(jià)電子躍遷

基態(tài)分子價(jià)電子躍遷到激發(fā)態(tài)光照激發(fā)去激發(fā)光*

*n基態(tài)在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過程中，分子中的價(jià)電子（、n電子）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子自旋狀態(tài)的多重性來描述一、熒光光譜基本原理第九頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光涉及吸收和發(fā)射兩個(gè)過程在同一軌道上成對(duì)電子相反方向自旋更穩(wěn)定分立軌道上非成對(duì)電子平行自旋更穩(wěn)定ABC能量（一）電子自旋狀態(tài)的多重性第十頁，共九十四頁，2022年，8月28日（一）電子自旋狀態(tài)的多重性大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，基態(tài)分子每一個(gè)軌道中兩個(gè)電子自旋方向總是相反的，處于基態(tài)單重態(tài)。用“S0”表示；當(dāng)物質(zhì)受光照射時(shí)，基態(tài)分子吸收光能產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷，由基態(tài)躍遷至更高的單重態(tài)，電子自旋方向沒有改變，凈自旋=0?；鶓B(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)單重態(tài)S*1S0,S*1,S*2,S*3分別代表基態(tài),第一,二,三激發(fā)單重態(tài)激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8S第十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變，由基態(tài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷

T*1、T*2、T*3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)三重態(tài)T*1自旋平行激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-4~10S第十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程（二）熒光、磷光的產(chǎn)生的機(jī)制當(dāng)處于基態(tài)單線態(tài)（S0）的分子吸收波長為λ1和λ2的輻射后,分別被激發(fā)到第一激發(fā)單線態(tài)（S1*）和第二激發(fā)單線態(tài)(S2*)的任意振動(dòng)能級(jí)上,而后發(fā)生以下過程：第十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程振動(dòng)弛豫VR:處于激發(fā)態(tài)的分子，其電子躍遷到第一激發(fā)態(tài)（S*1）或更高激發(fā)態(tài)的不同振動(dòng)軌道上，分子可以從這些能態(tài)以非輻射形式放出能量而到達(dá)同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，這一過程稱為振動(dòng)馳豫，時(shí)間約為10-12s數(shù)量級(jí)。第十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程內(nèi)部轉(zhuǎn)換ic:當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾缕湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，如第一激發(fā)單線態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)與第二激發(fā)單線態(tài)S*2的某一較低振動(dòng)能級(jí)的位能相同，可發(fā)生電子由高能級(jí)以無輻射躍遷的方式躍遷至低能級(jí)上。此過程效率高，速度快，一般只需10-13-10-11s。

第十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程熒光發(fā)射:處于激發(fā)單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)S*1的分子，也存在幾種可能的去激化過程。若以10-9-10-7s左右的時(shí)間發(fā)射光量子回到基態(tài)S0的各振動(dòng)能級(jí)，這時(shí)分子發(fā)射的光量子即稱為熒光。第十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程外部轉(zhuǎn)化ex:部分激發(fā)態(tài)分子在分子間、分子與溶劑分子間或與其他分子間相互碰撞而失去能量，回到基態(tài)。這是一種熱平衡過程，屬無輻射躍遷。這一過程約需10-9~10-7s。第十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程系間竄越isc:如果第一激發(fā)單線態(tài)S*1的較低振動(dòng)能級(jí)同三線態(tài)T*1的較高振動(dòng)能級(jí)重疊，即有了電子自旋反轉(zhuǎn)發(fā)生的可能性；電子由單線態(tài)S*1以無輻射躍遷的方式到三線態(tài)T*1的過程稱為系間竄越，約需10-6~10-2s。第十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程磷光發(fā)射:經(jīng)過系間竄越的分子再通過振動(dòng)馳豫降至三線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后發(fā)出光輻射躍遷至基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，這種光輻射稱為磷光。這一過程約需10-4~10s。第十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子內(nèi)的激發(fā)和去激化過程激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉(zhuǎn)化的形式和速率：A1,A2吸收:VR振動(dòng)弛豫：10-12sic內(nèi)部轉(zhuǎn)化：10-11sF熒光：10-9~10-7sex外部轉(zhuǎn)化:10-9~10-7s(熄滅現(xiàn)象)isc系間竄越：

10-6~10-2sP磷光：10-4~100s第二十頁，共九十四頁，2022年，8月28日分子中電子受激躍遷到激發(fā)態(tài)后，處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，去激返回到較低激發(fā)態(tài)或基態(tài)時(shí)有兩種方式：無輻射去激和輻射去激。第二十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日無輻射去激——不伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程叫無輻射去激，體系內(nèi)的多余的能量以熱的形式釋放。包括：內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC）—相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-S系間竄躍（ISC）—不同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-T振動(dòng)馳豫（VR）—同一電子能級(jí)中，從較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)的過程外部轉(zhuǎn)移（EX）—指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消滅發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1—T1間進(jìn)行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難第二十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日輻射去激——伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程叫輻射去激。包括：熒光——激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)單線態(tài)S*1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷，產(chǎn)生速度快，10-9~10-7s，又叫快速熒光或瞬時(shí)熒光，外部光源停止照射，熒光馬上熄滅。無論開始電子被激發(fā)至什么高能級(jí)，它都經(jīng)過無輻射去激消耗能量后到S*1的最低振動(dòng)能級(jí)，發(fā)射熒光，熒光波長比激發(fā)光波長長。λ熒>λ激第二十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日輻射去激——伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程叫輻射去激。包括：磷光——當(dāng)受激電子降到S*1的最低振動(dòng)能級(jí)后，未發(fā)射熒光，而是經(jīng)過系間竄躍到T*1振動(dòng)能級(jí)，經(jīng)振動(dòng)馳豫到T*1最低振動(dòng)能級(jí)，從T*1最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)所發(fā)射的光叫磷光。從T*1→S0要改變電子自旋，發(fā)光速度慢，約為10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時(shí)間。分子相互碰撞的無輻射能量損耗大，所以磷光的波長更長：λ磷>λ熒>λ激

*易產(chǎn)生熒光

n*易產(chǎn)生磷光第二十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日注意：實(shí)現(xiàn)內(nèi)部轉(zhuǎn)換a、S*1

S*2電子能級(jí)差小，易實(shí)現(xiàn)

b、S*1

S*2振動(dòng)能級(jí)有位能交叉面體系間竄越的必要條件a、S*1T*1振動(dòng)能級(jí)有位能交叉面b、微觀磁場(chǎng)的微擾存在帶電粒子的極性分子或可極化分子易產(chǎn)生磁效應(yīng)順磁性分子O2…外層3d5五個(gè)電子不成對(duì)，易形成微觀磁場(chǎng)BrI…等重原子分子（分子量大）或離子外層電子云疏松電子自旋與微磁場(chǎng)偶合激發(fā)態(tài)電子自旋反轉(zhuǎn)分子多重態(tài)變化外部轉(zhuǎn)化使發(fā)光熄滅現(xiàn)象，T*1→S0較S*1→S0可能性大去激化眾多過程中，以速度最快、激發(fā)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)，相互競(jìng)爭第二十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光分析儀器——主要由光源、單色器、樣品池、檢測(cè)器和顯示器組成光源第一單色器樣品池檢測(cè)器第二單色器檢測(cè)器放大器及記錄器exem與紫外分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同①兩個(gè)單色器②檢測(cè)器與激發(fā)光互成直角I0I二、熒光分析儀器第二十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光儀器的光路示意圖A光電熒光計(jì)第一濾光片第二濾光片電表光電管樣品池狹縫汞弧燈樣品池檢測(cè)器光源B熒光分光光度計(jì)二、熒光分析儀器第二十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長范圍寬熒光計(jì)中，常使用高壓汞燈作光源熒光光度計(jì)中常用氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源第二十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日2、單色器熒光計(jì)用濾光片作單色器，熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長ex，用此激發(fā)光激發(fā)樣品池內(nèi)的熒光物質(zhì)ex第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測(cè)定用的熒光波長em。在選定的em下測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析第二十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日3、樣品池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測(cè)器把光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào),放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度5、讀出裝置記錄儀記錄或打印機(jī)打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜第三十頁，共九十四頁，2022年，8月28日磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測(cè)定低溫磷光（將樣品池放在盛放液氮的杜瓦瓶內(nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。第三十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜羅丹明B激發(fā)光譜羅丹明B發(fā)射光譜羅丹明B激發(fā)和發(fā)射光譜第三十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜任何熒光物質(zhì)都具有兩個(gè)特征光譜，即激發(fā)光譜和熒光光譜。激發(fā)光譜:是指不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光所得的光譜。獲得方法：先把第二單色器的波長固定，使測(cè)定的em不變，改變第一單色器波長，從200~700nm掃描，讓不同波長的光照在熒光物質(zhì)上，測(cè)定它的熒光強(qiáng)度。以激發(fā)波長（λex）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（F）為縱坐標(biāo)作圖，便可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。固定em熒光波長從曲線上找出ex，實(shí)際上選波長較長的高波長峰第三十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜發(fā)射光譜（熒光光譜）:固定激發(fā)光波長和強(qiáng)度，測(cè)定熒光波長與熒光強(qiáng)度的變化所得的光譜。獲得方法：先把第一單色器的波長固定，使激發(fā)的λex不變，改變第二單色器波長，讓不同波長的光掃描，測(cè)定它的發(fā)光強(qiáng)度（F），以F為縱坐標(biāo)，λem為橫坐標(biāo)得右圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜。固定ex激發(fā)光波長從曲線上找出最大的em第三十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日注意：熒光物質(zhì)的最大激發(fā)光波長和最大熒光波長是鑒定物質(zhì)的依據(jù)，也是定量測(cè)定時(shí)最靈敏的光譜條件。實(shí)際測(cè)得的熒光光譜和激發(fā)光譜隨儀器而異，其真實(shí)光譜必須要對(duì)光源、單色器、檢測(cè)器的光譜特性加以校正。真實(shí)的激發(fā)光譜與紫外吸收光譜非常近似，而不是相同。第三十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日四、溶液熒光光譜的特征⑴斯托克斯位移：λ熒光＞λ激發(fā)光；原因：溶劑化效應(yīng)非輻射損失⑵熒光光譜與激發(fā)光波長無關(guān)原因？⑶熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系原因？第三十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑵熒光光譜與激發(fā)光光波長無關(guān)原因？如硫酸奎寧的激發(fā)光譜有兩個(gè)峰，而對(duì)應(yīng)的熒光光譜僅一個(gè)峰。這是因?yàn)槲镔|(zhì)分子可以從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)S1*或第二電子激發(fā)態(tài)，因此激發(fā)光譜有兩個(gè)峰。但不管分子躍遷至S1*或S2*，都會(huì)經(jīng)過無輻射躍遷下降至S1*的最低振動(dòng)能級(jí)，再躍遷至基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)出熒光。硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜因此，當(dāng)熒光物質(zhì)的激發(fā)光光譜有兩個(gè)峰時(shí)，不管用哪一個(gè)峰的波長作激以光，也就是說不管分子躍遷至S1*和S2*，熒光的發(fā)生總是從的最低振動(dòng)能級(jí)開始，熒光光譜只有一個(gè)峰。第三十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑶熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系原因？蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜

A1A2Baaaabbbbb第三十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光形成機(jī)制單重態(tài)第二激發(fā)態(tài)第一激發(fā)態(tài)三重態(tài)熒光內(nèi)轉(zhuǎn)換體系跨越振動(dòng)弛豫基態(tài)S1與S0振動(dòng)能級(jí)相似第三十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日物質(zhì)需有強(qiáng)的紫外吸收：物質(zhì)只有吸收了紫外-可見光，產(chǎn)生*n*躍遷，產(chǎn)生熒光。*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102~103，壽命短，*躍遷常產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，n*躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強(qiáng)的磷光。物質(zhì)需有高的熒光效率：熒光效率低的物質(zhì)雖然有強(qiáng)的紫外吸收，但所吸收的能量都以無輻射躍遷形式釋放，內(nèi)部淬滅的速度很快，所以沒有熒光發(fā)射。五、熒光物質(zhì)的必要條件第四十頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光效率發(fā)射熒光的量子數(shù)吸收激發(fā)光量子數(shù)f是一個(gè)物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，f越大，熒光越強(qiáng)，在0~1之間。熒光強(qiáng)度常用熒光量子效率φf來描述：物質(zhì)發(fā)射熒光的量子數(shù)和所吸收的激發(fā)光量子數(shù)的比值稱為熒光效率。

熒光效率f=第四十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響外部因素：外界條件對(duì)熒光效率的影響影響熒光效率的因素第四十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日1.長共軛結(jié)構(gòu)——有較強(qiáng)的熒光具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長越長，發(fā)射的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長長（一）分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響第四十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定3，4-苯并芘是強(qiáng)致癌物ex=386nm

em=430nm第四十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日除了芳香烴外，含有長共軛雙鍵的脂肪烴也可能有熒光，但這一類化合物的數(shù)目不多，維生素A是能發(fā)生熒光的脂肪烴之一。ex=327nm

em=510nm第四十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.分子的剛性和共平面性——較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)熒光素：氧橋把兩個(gè)環(huán)固定在一個(gè)平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強(qiáng)熒光物質(zhì)酚酞：無氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)第四十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體第四十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日本身不發(fā)生熒光體或發(fā)生弱熒光的物質(zhì)，一旦與Mn+形成螯合物后，如果剛性和共平面性增強(qiáng)，就可以發(fā)生熒光或增強(qiáng)熒光。例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強(qiáng)大多數(shù)無機(jī)鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，可用于痕量金屬離子的測(cè)定。第四十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.取代基的類型——取代基對(duì)熒光物質(zhì)的熒光特征和強(qiáng)度也有很大影響。分成三類：（1）增強(qiáng)熒光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的n電子（孤對(duì)電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)第四十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日（2）減弱熒光的取代基——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長短移，熒光強(qiáng)度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為內(nèi)重原子效應(yīng)。（3）影響不明顯的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等第五十頁，共九十四頁，2022年，8月28日（二）外界條件對(duì)熒光效率的影響1.溶劑的影響：同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)：一般來說，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增大。溶劑黏度減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑黏度的增加而增加。含有重原子的溶劑，如四溴化碳（CBr4）、碘乙烷等，由于外重原子效應(yīng)使物質(zhì)熒光減弱。溶劑如能與溶質(zhì)分子形成穩(wěn)定氫鍵，處在S1*V0的分子將減少，從而減弱其熒光。第五十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日（二）外界條件對(duì)熒光效率的影響2.溫度的影響——低溫下測(cè)定，提高靈敏度因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度減弱。溫度對(duì)磷光影響更大第五十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大共軛酸堿對(duì)是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光第五十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日但兩個(gè)苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無熒光另外，表面活性劑也會(huì)影響熒光強(qiáng)度和特性第五十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅?！篃晒鈴?qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑4.熒光猝滅劑的影響第五十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光猝滅的形式很多。例如：碰撞猝滅——M+激→M*M*+Q→M+Q+熱熒光分子與猝滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的絡(luò)合物在熒光物質(zhì)的分子中引入溴或碘后，易發(fā)生體系間跨越而轉(zhuǎn)變至三線態(tài)溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)被氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進(jìn)了體系間跨越，使激發(fā)態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)成三線態(tài)第五十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光猝滅劑在熒光分析中會(huì)產(chǎn)生測(cè)定誤差。但是，如果一個(gè)熒光物質(zhì)在加入某猝滅劑后，熒光強(qiáng)度的減小和熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，則可利用這一性質(zhì)測(cè)定熒光猝滅劑的含量。這種方法稱為熒光熄滅法。例如：利用氧分子對(duì)硼酸根-二苯乙醇酮絡(luò)合物的熒光猝滅效應(yīng)，可進(jìn)行微量氧的測(cè)定。第五十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日自熄滅——熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。在熒光物質(zhì)超過1g/L時(shí)，由于熒光物質(zhì)分子間碰撞的概率增加，產(chǎn)生熒光自熄滅現(xiàn)象，溶液濃度越高，這種現(xiàn)象越嚴(yán)重。第五十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日當(dāng)一束平行光投射在液體樣品上，大部分光線透過溶液，小部分由于光子和物質(zhì)相互碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。5.散射光的干擾光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時(shí)，不發(fā)生能量交換，僅僅是光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變，這種散射光稱為瑞利光。特征：散射光波長=激發(fā)光波長。光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時(shí)，光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變的同時(shí)，發(fā)生能量交換，這種散射光稱為拉曼光。特征：當(dāng)光子失去部分能量時(shí)，波長比入射光長，干擾最大；當(dāng)光子多得到部分能量時(shí)，波長比入射光短。消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長可消除拉曼光干擾。第五十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日例：5.散射光的干擾320448448360320350400350激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm0.1mol/LH2SO4激發(fā)320nm0.1mol/LH2SO4強(qiáng)度(a)強(qiáng)度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜第六十頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系定量分析方法六、定量分析方法第六十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日（一）熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系用強(qiáng)度為I0的入射光，照射到樣品池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If用儀器測(cè)得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度If與濃度有下面的關(guān)系：If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度熒光池I0IIf熒光強(qiáng)度檢測(cè)器If=f（I0-I010-A）=fI0

（1-e-2.3A）I=I010-A將上式展開第六十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日當(dāng)A﹤0.05時(shí)，方括號(hào)中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡化If=2.3fI0A=2.3fI0bc當(dāng)A﹤0.05時(shí)，If與f、I0、和c有關(guān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、和b為常數(shù)，合并為K

If=KCIp=KC定量分析依據(jù)第六十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系，If=KC只有在濃度低時(shí)使用，熒光物質(zhì)測(cè)定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時(shí)，If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大，If反而降低因?yàn)楣絒]中后面影響，有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)注意：第六十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日（二）定量分析方法定量分析依據(jù)If=KCIp=KC1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最常用的定量分析方法將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試樣在相同條件下處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定它們的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。以相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)濃度C1C2C3C4C5

Cx熒光強(qiáng)度If1If2If3If4If5

IfxIfIfxCxC第六十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.比較法——比較簡單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進(jìn)行測(cè)量配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Cs，Cs與未知液濃度Cx相近，并在相同條件下測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度未知液If

x=KCx標(biāo)準(zhǔn)液If

s=KCs

比較第六十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日如果空白溶劑的熒光強(qiáng)度調(diào)不到零，必須從If

x和If

s值中扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度If

0，然后計(jì)算：第六十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.多組分混合物的熒光分析(1)如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測(cè)定可分別在各自的熒波長處測(cè)定,求出它們的含量(2)如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個(gè)組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光;可選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定第六十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日Al3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=436nm

em=520nm365nm激發(fā)光，Al3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Ga3+配合物不產(chǎn)生熒光，無熒光峰；436nm激發(fā)光，Ga3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Al3+配合物不產(chǎn)生熒光，無熒光峰在365nm條件下激發(fā)，520nm處測(cè)Al3+—8-羥基喹啉配合物，在436nm條件下激發(fā)，520nm處測(cè)Ga3+—8-羥基喹啉配合物例：第六十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日(3)如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾利用熒光強(qiáng)度的加和性（F=F1+F2+F3+…），在適宜的熒光波長處測(cè)定，用聯(lián)立方程來求解例：硫胺熒CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺熒CP

ex=410nm

em=480nm相互干擾熒光光譜重疊在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度第七十頁，共九十四頁，2022年，8月28日在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度If435/385=26339104CT+210104CPIf480/385=9685104CT+1022104CPIf480/410=2816104CT+1709104CPIf435/410=6419104CT+252104CP硫胺素濃度吡啶硫胺素濃度If=KC——K:純物質(zhì)在選定波長下測(cè)If,求K385nm激發(fā)或410nm激發(fā)第七十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日無機(jī)化合物的分析有機(jī)化合物的分析磷光分析法應(yīng)用七、熒光分析法的應(yīng)用第七十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日1.無機(jī)化合物的分析熒光分析法具有靈敏度高、取樣量少等優(yōu)點(diǎn)無機(jī)化合物中，能直接產(chǎn)生熒光并應(yīng)用于測(cè)定的為數(shù)不多，但與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測(cè)定的元素有：Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能夠同金屬離子形成熒光配合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，變?yōu)閺?qiáng)熒光體熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法?？刹捎脽晒忖绶ㄩg接測(cè)定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等第七十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.有機(jī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測(cè)定方法第七十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日為提高測(cè)定的靈敏度，有時(shí)也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進(jìn)行測(cè)定可測(cè)定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等第七十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘為強(qiáng)致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，汽車尾氣也是主要來源食品加工過程也會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品分析測(cè)定：用環(huán)己烷將3，4–苯并芘從試樣中提取出來，用堿將提取液的脂肪類物質(zhì)皂化，然后用色譜法分離純化，用95%C2H5OH稀釋，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量第七十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日例：VB2——又稱核黃素，是一種生長促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶液。在低濃度情況下，I=KC，I與C呈線性關(guān)系，在pH6~7熒光最強(qiáng)在430~440nm藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，em=535nm下測(cè)I，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定缺VB2會(huì)得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎維生素B2第七十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.磷光分析法應(yīng)用能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)數(shù)量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環(huán)境分析領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。低溫磷光分析已應(yīng)用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴及含O、S、N的雜環(huán)化合物分析固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段。第七十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日專題講座主要內(nèi)容：1、RT-PCR技術(shù)2、多功能酶標(biāo)的應(yīng)用3、蛋白質(zhì)研究的新方法—雙色紅外激光成像地點(diǎn)：九里校區(qū)4308時(shí)間：2010年4月20日上午9：50至11：50歡迎有興趣的老師和同學(xué)參加第七十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日§2-3化學(xué)發(fā)光分析法一、概述化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象所建立的分析方法化學(xué)發(fā)光與熒光的主要區(qū)別：受激發(fā)時(shí)所需的能量來源不同，需要化學(xué)反應(yīng)過程中所提供的化學(xué)能第八十頁，共九十四頁，2022年，8月28日化學(xué)發(fā)光分析具有以下特點(diǎn)靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測(cè)定低至2×10-17mol·L-1ATP線性范圍寬——一般有5~6個(gè)數(shù)量級(jí)儀器設(shè)備簡單，成本低廉分析速度快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究第八十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理（一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件發(fā)光反應(yīng)必須滿足以下條件1.化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能化學(xué)發(fā)光基于化學(xué)反應(yīng)提供足夠的能量A+B→C*+D產(chǎn)物接受反應(yīng)能被激發(fā)C*→C+h在可見光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能。具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求?；瘜W(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的高能反應(yīng)中2.處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)第八十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日（二）化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光效率CL激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率r取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身f與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響第八十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中。亦稱生物發(fā)光。如：螢火蟲發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎接近100%。非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過1%化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ICL（t）與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系對(duì)下列化學(xué)發(fā)光反應(yīng)A+B→C*+D

C+hICL隨時(shí)間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小第八十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日A+B→C*+DA為待測(cè)物質(zhì)，C為發(fā)光物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量于待測(cè)物濃度時(shí)，B的濃度可認(rèn)為是常數(shù)。因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)