第五章 植物的胚胎培養(yǎng)及離體

第五章植物的胚胎培養(yǎng)及離體第一頁，共三十一頁，2022年，8月28日Hanning(1904)最早在無菌條件下進(jìn)行十字花科辣根菜、蘿卜成熟胚培養(yǎng)獲得成功。Laibach(1925，1929)用宿根亞麻×奧地利亞麻（Linumperenne×L.austriacum）胚培養(yǎng)，得到了雜種植物。因為在遠(yuǎn)緣雜交的組合中，植物所結(jié)的種子發(fā)育不良，不能萌發(fā)?？蓪⑴咧糜谌斯づ囵B(yǎng)基上培養(yǎng)成功。在高等植物種間或?qū)匍g遠(yuǎn)緣雜交時的問題:①由于不親和性，常常還會發(fā)生花粉不能在異種植物柱頭上萌發(fā)或花粉管生長受到抑制不能進(jìn)入子房的受精前障礙。②或即使受精，由于胚乳發(fā)育不良或因胚與胚乳間不親和而使胚在早期敗育。胚胎培養(yǎng)可以在胚乳發(fā)育不良時，把胚在早期及時取出培養(yǎng)，有可能獲得雜交的成功。第二頁，共三十一頁，2022年，8月28日第一節(jié)植物胚胎培養(yǎng)的類型和應(yīng)用植物胚胎培養(yǎng)（Embryoculture）是指胚和胚器官（子房、胚珠）在離體條件下培養(yǎng)發(fā)育成完整植株的技術(shù)。一、胚培養(yǎng)類型

兩類:幼胚與成熟胚培養(yǎng)

成熟胚一般在比較簡單的培養(yǎng)基上就能萌發(fā)生長，成熟胚生長依賴胚乳、子葉的貯藏營養(yǎng)，培養(yǎng)基要求簡單。只要提供合適的生長條件以及打破休眠，即可萌發(fā)成幼苗。

成熟胚培養(yǎng)技術(shù)要求不嚴(yán)格，將受精后的果實或種子（帶種皮），表面消毒后，剝?nèi)》N胚,接種于培養(yǎng)基上，即可發(fā)育成為一個完整的植物體。第三頁，共三十一頁，2022年，8月28日

幼胚指尚未成熟（發(fā)育早期）的胚。在離體培養(yǎng)時比成熟胚培養(yǎng)困難，要求的技術(shù)和條件較高。幼胚離體培養(yǎng)有兩種不同的生長方式：

1)繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持胚性生長。

2)迅速萌發(fā)為幼苗，不維持胚性生長，這種情況稱為“早熟萌發(fā)”（precociousgermination）。早熟萌發(fā)形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至引起死亡。第四頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、培養(yǎng)方法

1、材料的選擇與滅菌取回大田或溫室里種植的雜交植物的子房，用70%的酒精進(jìn)行幾秒鐘表面消毒，再用0.1%HgCl2滅菌10～30min，無菌水沖洗，即可用于外植體的分離和培養(yǎng)。第五頁，共三十一頁，2022年，8月28日2、幼胚的分離及培養(yǎng)

①幼胚的剝離②幼胚的培養(yǎng)

胚胎發(fā)育過程分為兩個時期：

1）異養(yǎng)期（heterotrophyperiod），即在胚發(fā)育早期，幼胚由胚乳及周圍的組織提供養(yǎng)分。

2）自養(yǎng)期(autotrophyperiod)，胚在代謝上已經(jīng)能在基本的無機(jī)鹽和蔗糖的合成培養(yǎng)基上生長，在營養(yǎng)上已相當(dāng)獨立。

第六頁，共三十一頁，2022年，8月28日Monnier(1976,1978)介紹了一種培養(yǎng)方法第七頁，共三十一頁，2022年，8月28日胚乳看護(hù)培養(yǎng)

Ziebur等(1951)報道，在進(jìn)行大麥未成熟胚離體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基上存在來自同一物種另一種子的離體胚乳，對胚的生長有明顯的促進(jìn)作用。谷類胚胎嫁接的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大麥胚移植到小麥的胚乳上時，比在大麥胚乳上生長更好。

Kruse(1974)在某些屬間雜交中，若把雜交未成熟的胚放在事先培養(yǎng)的大麥胚乳上培養(yǎng)，能顯著提高獲得雜種植株的頻率。大麥（Hordeumvulgare）×黑麥(Secalecereale)屬間雜交，采用這種方法有30%～40%的雜種未成熟胚可以發(fā)育成苗，而用傳統(tǒng)的胚培養(yǎng)法只有1%能成功。第八頁，共三十一頁，2022年，8月28日Delautour等（1980）改良胚乳看護(hù)培養(yǎng)（圖4-2）。他們把雜種離體幼胚嵌入到由雙親之一胚乳中，然后把二者一起放在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。第九頁，共三十一頁，2022年，8月28日三、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用

1．克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性

在遠(yuǎn)緣雜交中，由于雙親遺傳和生理的不親和性，產(chǎn)生受精障礙或胚乳不能正常發(fā)育，導(dǎo)致雜種發(fā)育不良或早期夭折。利用胚胎培養(yǎng)或分離早期幼胚培養(yǎng)，在試管中培養(yǎng)成再生植株，可防止遠(yuǎn)緣雜交中優(yōu)良種質(zhì)的丟失。2．打破種子休眠

一些種子發(fā)育不完全或有抑制物存在而影響種胚發(fā)芽。利用含有糖和無機(jī)鹽的培養(yǎng)基進(jìn)行胚培養(yǎng)，可使這些植物的幼胚達(dá)到生理和形態(tài)上的成熟而萌發(fā)成植株。3．縮短育種周期

常規(guī)育種和胚培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可縮短育種時間。4．克服種子的自然不育性

長期營養(yǎng)繁殖的植物，雖然具有形成種子的能力，但種子生活力較低。胚培養(yǎng)有可能促進(jìn)這類種子萌發(fā)和形成幼苗。第十頁，共三十一頁，2022年，8月28日四、影響胚培養(yǎng)的因素（一）、培養(yǎng)基：

1．無機(jī)鹽成熟胚的培養(yǎng)基較簡單。主要有Turkey、Randolph、white等.以大量元素和微量元素的無機(jī)鹽為基本成分。幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基為常用的MS、B5、Nitsch以及Rijven、Rangaswang、Norstog等培養(yǎng)基。第十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日2．碳水化合物

糖在胚培養(yǎng)中具有三個方面的作用：①調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、②作為碳源和能源、③防止幼胚的早熟萌發(fā)。成熟胚在低濃度（含2%）蔗糖的培養(yǎng)基中生長很好。但幼胚要求較高水平的碳水化合物。未成熟胚加入蔗糖的最重要的作用是保持培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)臐B透壓。如果蔗糖濃度過低易引起胚胎過早萌發(fā)。

Paris等（1953）在培養(yǎng)小于0.3mm的曼陀羅(Dstramonium)胚時，發(fā)現(xiàn)其適宜的蔗糖濃度為5%，而較低的蔗糖濃度對較大的成熟胚生長適合。第十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日3．其它成分

氨基酸：谷氨酰胺、水解酪蛋白被廣泛。維生素類：有硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣等。維生素對發(fā)育初期的幼胚的培養(yǎng)來說是必須的。外源激素：成熟胚生長一般不需要即可萌發(fā)，而加入一定量的激素可顯著增加培養(yǎng)物的生長、并利于休眠種胚的萌發(fā)。

外源生長物質(zhì)和植物內(nèi)源激素之間某種平衡，是維持幼胚胚性生長的關(guān)鍵。如果激素濃度低，則不能促進(jìn)其生長；如果激素濃度過高，將會使幼胚發(fā)生脫分化而影響其正常發(fā)育。天然提取物：如椰乳、大麥胚乳、麥芽、馬鈴薯塊、大豆等提取物，對胚生長有促進(jìn)作用。

VanOverbeek等使用椰子汁培養(yǎng)曼陀羅的心形胚獲得成功。王伏雄（1963）發(fā)現(xiàn)蜂王漿對銀杏幼胚正常分化有促進(jìn)作用、胚的死亡率減少、抑制胚形成愈傷組織。第十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日（二）、環(huán)境條件1．溫度對大多數(shù)植物胚的培養(yǎng)來說，溫度保持在25～30℃較為合適。而在20℃下馬鈴薯胚培養(yǎng)較好。在25～30℃范圍內(nèi)柑橘、蘋果、梨合適。32℃時棉花胚生長最好。桃則需要變溫條件下進(jìn)行。2．光照光對胚胎發(fā)育有抑制作用，一般黑暗或弱光下利于幼胚的培養(yǎng)。（三）、胚柄對幼胚培養(yǎng)的影響研究表明，胚柄參與幼胚的發(fā)育過程。當(dāng)胚發(fā)育到球形期時，胚柄也發(fā)育到最大。紅花菜豆中，較老的胚，不管有無胚柄的存在，均能在培養(yǎng)基中生長；但幼胚培養(yǎng)，不帶胚柄會顯著降低形成小植株的頻率。第十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日胚乳培養(yǎng)(endospermculture)是指將胚乳組織從母體上分離出來，通過離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的過程。

裸子植物中胚乳是由雌配子體發(fā)育而成的，是單倍體。被子植物中胚乳一般是雙受精的產(chǎn)物，是由兩個極核和一個雄配子融合而成的三倍體。而待宵草型胚囊只有一個極核與精細(xì)胞融合，胚乳為2n。第二節(jié)植物胚乳的培養(yǎng)第十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日第十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日一、培養(yǎng)方法（一）胚乳外植體的制備將整個果實進(jìn)行表面消毒，在無菌條件下切開幼果，取出種子，小心分離胚乳，接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。（二）胚乳愈傷組織再生植株1．愈傷組織的誘導(dǎo)

少數(shù)植物可以直接從胚乳分化出器官外，大多數(shù)被子植物的胚乳，無論是未成熟或成熟的，都首先形成愈傷組織，然后分化植株。2．器官發(fā)生途徑

器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型均有。

第十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日（三）三倍體后代的特征1．形態(tài)特征：

粗壯，葉片大而肥厚，葉色濃，花型大或重瓣，果實大但結(jié)實率低。2．胚乳再生植株的倍性在胚乳培養(yǎng)中常常發(fā)生染色體倍性的混亂現(xiàn)象。即多數(shù)胚乳培養(yǎng)具有多種數(shù)目的染色體細(xì)胞組成。

黃貞光等（1982）報道，來源于獼猴桃同一植株的胚乳，可以培養(yǎng)出三倍體和二倍體兩種倍性的植株。影響胚乳細(xì)胞在培養(yǎng)中染色體穩(wěn)定性的因素主要有：胚乳的類型、胚乳愈傷組織發(fā)生的部位以及培養(yǎng)基中外源激素的種類和水平。

第十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、影響胚乳培養(yǎng)的因素1．培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件1）常用的基本培養(yǎng)基有MT、LS、MS等。2）添加有機(jī)物，如水解酪蛋白和酵母提取物．

3）同時加入細(xì)胞分裂素和生長素，愈傷組織正常生長，其效果顯著優(yōu)于使用單一的生長素或細(xì)胞分裂素。

4）蔗糖的濃度一般為3%～5%。5）適宜培養(yǎng)溫度為25℃左右．第十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日2．胚在胚乳培養(yǎng)中的作用胚乳培養(yǎng)中，分為：帶胚培養(yǎng)、不帶胚培養(yǎng)兩種方式。

帶胚培養(yǎng)胚乳比不帶胚的胚乳組織容易形成愈傷組織，當(dāng)愈傷組織形成后，除去胚并不影響胚乳組織的增殖。未成熟胚乳，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上沒有胚的存在就能形成愈傷組織。而成熟的胚乳，必須借助于胚的萌發(fā)使其活化。胚對胚乳組織的增殖作用，被認(rèn)為是某種“胚性因子”在起作用。這種“胚性因子”可能就是赤霉素。第二十頁，共三十一頁，2022年，8月28日三、胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用1）三倍體幼苗和植株的獲得，對于一些無性繁殖的植物具有重要經(jīng)濟(jì)價值。2）胚乳植株染色體的不穩(wěn)定性，為染色體工程的研究提供有效的途徑。

3）為研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等產(chǎn)物的生物合成及其代謝，提供了良好的實驗系統(tǒng)。第二十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日第三節(jié)植物胚珠和子房培養(yǎng)一、胚珠培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)是將授粉的子房在無菌的條件下解剖后，取出胚珠置于培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程。胚珠是種子植物的大孢子囊，是孕育雌配子體的場所，也是種子形成的前身。根據(jù)培養(yǎng)胚珠的不同目的，可將胚珠培養(yǎng)分為受精胚珠的培養(yǎng)和未受精胚珠的培養(yǎng)兩種形式。第二十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日（一）胚珠培養(yǎng)的意義1．利用胚珠培養(yǎng)技術(shù)，對雜種在胚珠時期開始培養(yǎng)，可獲得雜種植株，防止雜種胚早期敗育。2．用未受精的胚珠培養(yǎng)以及未受精的胎座或子房培養(yǎng)可以作為試管受精的技術(shù)基礎(chǔ)。3．在未受精的胚珠培養(yǎng)中可以誘導(dǎo)單倍體植株。第二十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日（二）胚珠培養(yǎng)方法1．材料的選擇和滅菌培養(yǎng)受精胚珠，取回授粉時間合適的子房；培養(yǎng)未受精的胚珠，則應(yīng)在授粉前適當(dāng)時間摘取子房。進(jìn)行常規(guī)表面消毒后，剝離子房，縱切開子房，將胚珠一個個取出來，或者將帶有胎座部分的胚珠一起取下接種。2.胎座和子房對胚珠培養(yǎng)的影響帶有胎座或子房的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)時，所需培養(yǎng)基較簡單，而且受精后不久的胚珠也容易發(fā)育成種子。因此，在進(jìn)行單個胚珠培養(yǎng)不能成功時，?？煽紤]用帶有胎座或子房一起進(jìn)行培養(yǎng)。第二十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、子房培養(yǎng)子房培養(yǎng)是指將子房從母體上分離下來，放在人工配制的培養(yǎng)基上，使其進(jìn)一步生長發(fā)育成為幼苗的過程。子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座、胚珠組成。（一）培養(yǎng)方法1．子房外植體的制備子房培養(yǎng)的程序和方法與胚珠培養(yǎng)相似2.培養(yǎng)子房的發(fā)育子房存在兩種細(xì)胞，即性細(xì)胞和體細(xì)胞，它們都可產(chǎn)生胚狀體或愈傷組織，進(jìn)一步發(fā)育成不同倍性的植株。

胚囊里的雌配子體的核是由大孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂發(fā)育而來，產(chǎn)生的植株是單倍體。如來源于體細(xì)胞，即由珠被和子房壁表皮二倍體組織產(chǎn)生的植株，屬于二倍體植株。第二十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日（二）影響子房培養(yǎng)的因素受精前或受精后植物的子房，通過離體培養(yǎng)，都可形成果實，并得到成熟的種子。這種培養(yǎng)方式所要求的培養(yǎng)基也較簡單，常用的培養(yǎng)基有N6、MS、NB等。使子房性細(xì)胞和體細(xì)胞通過誘導(dǎo)胚狀體或愈傷組織，并分化成植株，則對培養(yǎng)基的成分有一定的要求。如誘導(dǎo)未受精子房胚囊核單倍體組織發(fā)生，就需要在培養(yǎng)基中加入一定量的外源激素。第二十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日第四節(jié)植物離體受精一、植物受精（一）植物離體授粉（pollinationinvitro)

指將未授粉的胚珠、子房或柱頭從母體上分離下來，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，并通過一定的方式授給無菌花粉，使其在試管內(nèi)實現(xiàn)受精的技術(shù)，又稱為試管受精或離體受精（fertilizationinvitro)。

優(yōu)點：離體授粉技術(shù)可以克服遠(yuǎn)緣雜交過程中受精前障礙，獲得可育性種子。（二）根據(jù)授粉的部位分為三種離體受精技術(shù)：胚珠授粉、子房授粉、柱頭授粉。第二十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日1、離體柱頭授粉：將無菌花粉授于離體培養(yǎng)的雌蕊（未受精的）柱頭上，得到含有可育性種子或果實的技術(shù),又稱為雌蕊離體授粉。2、離體子房授粉：在離體條件下，將無菌花粉直接引入子房中，使花粉粒在子房中萌發(fā)、完成受精，并獲得具有生活力的種子的技術(shù)?；ǚ哿Ｒ胱臃恐械姆椒ǎ孩僦苯右敕ǎ涸谧臃壳锌谔?，放入花粉粒。②注射法：將花粉粒用硼酸配成懸浮液，用無菌注射器注入子房中。3、離體胚珠授粉：在離體條件下，將無菌花粉在未受精的胚珠上授粉，得到可育性種子的過程。第二十八頁，共三十一頁，