酶法水解雞蛋白蛋白的工藝條件研究

大 學(xué)畢業(yè)論文院 與工程專業(yè)班級(jí) 食工成 績(jī)2009 年 6 月 20 日word摘 要酶解蛋清的最佳條件是：pH=8.5、度=50℃、[s]=3%、[E]/[S]=4/100、T=5h。關(guān)鍵詞 雞蛋白蛋白；蛋白酶；水解；多肽；水解度；抗氧化性word文檔 可自由復(fù)制編輯AbstractEggsisthefullpriceofagoodprotein.Itsstructureandcompositionissimilartohumanproteinsandthebiologicalvalueishigh.butbecauseofeatinghabitsandsomeofthespecialneedsofsomeindustries,thedemandforlargeeggyolk,theeggwhitehasbeendiscardedaswasteintheproductionprocess,causingagreatwasteoftheeggwhiteresourcesandcausedenvironmentalpollution.PreparationofhydrolysisofeggwhiteproteinpeptidesareeffectiveintheusingofeggwhiterichresourcesinChinawhichwillhaveahugecdls．Inthispaper,eggforrawmaterialstostudythehydrolysisofeggalbuminconditions.experimentsthroughsievetoyieldpeptidehydrolysis,theantioxidantenzymeselectedasanindexofthebesteggwhiteproteaseenzymeisacompound(animalbysinglefactorexperimentsandorthogonaltestcompoundderivedprotease(animalenyme)thebestconditionsforhydrolysisofeggwhitearpH=8.5,temperature=50,[s]=3%,[E]/[S]=4/100,T=5．Keywords:eggalbumin;protease;hydrolysis;peptide;degreeofhydrolysis;antioxidant目 錄word摘 要 I第一章 緒 論 111133[5] 344445第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 666679—[11] 9—-[12] —[13] —[14] 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 16七16標(biāo)準(zhǔn)曲線繪16結(jié)果 16word為料堿處理為料合（龐博公司）工藝條件研究 正交實(shí)驗(yàn)確定合（龐博公司）最佳工藝條件 章 結(jié) 論 33參考文獻(xiàn) 34致 謝 35word一章 緒 論雞蛋清蛋白概況雞蛋%%%主要分為水(75%)、質(zhì)(12%)、脂質(zhì)(12%)以及碳水化合物和礦物質(zhì)。三個(gè)組部分主要化學(xué)組見表1-1[1]。是人類豐富而平衡膳食營(yíng)養(yǎng)來(lái)源它富含質(zhì)、脂肪酸、鐵、磷、維生162DK[1ω-3脂肪酸被認(rèn)為能預(yù)防心率失常增強(qiáng)免疫力增進(jìn)人類大腦卵磷脂吸收增加血漿和大腦B2[2]；微量元素如硒、鋅等也都具有防癌作用。目前質(zhì)資源又污染了環(huán)境因此有必要對(duì)清進(jìn)行開發(fā)研究。表1-1雞蛋的化學(xué)組成部分質(zhì)脂類碳水化合礦物質(zhì)3.3--95.1清10.60.030.90.6黃16.632.61.01.1蛋白質(zhì)種類與含量%%其質(zhì)總含量了總量90%以上。清20多種質(zhì)且絕大多數(shù)為糖少數(shù)為磷糖。清一些主要質(zhì)1-2。清質(zhì)54于它含碳水化合物，歸類為磷糖是清唯一含游離巰基質(zhì)每個(gè)卵清4個(gè)巰基，并有一個(gè)雙硫基團(tuán)是清凝固和膠凝性質(zhì)主要因子。表1-2雞蛋清中一些主要蛋白質(zhì)的含量和理化特性[3]wordPa 量卵清544.545,00084.0磷糖卵轉(zhuǎn)鐵球126.176,00061.0結(jié)合金屬離子類卵粘114.128,00079.0抑胰酶卵粘3.54.5~5.05.5~8.3×106-Sialoprotein,粘性溶菌酶3.410.714,30075.0溶解某些種類細(xì)菌球G24.05.53.0~4.5×10492.5-球G34.04.8---卵抑物1.55.149,000- 抑絲氨酸酶卵糖1.03.924,400- -卵黃素0.84.032,000- 結(jié)合核黃素卵巨球白 0.5 4.5 7.6~9.0×105 - 具有強(qiáng)烈抗原性白5 0 0 0 素H）a等電點(diǎn)；T水或緩沖液中的變性溫度卵轉(zhuǎn)鐵球占整個(gè)清13%6Fe3+、Al3+、Cu2+、Zn2+形成穩(wěn)定的合物。卵轉(zhuǎn)鐵球與金屬離合物后熱變性和[4]，卵轉(zhuǎn)鐵球在鐵傳遞方面有重要作用，抗菌活性。清中溶菌酶E.C.3.2.1.17的在2～4%。溶菌酶的化學(xué)性穩(wěn)定，在廣泛pH內(nèi)1.～11.酶結(jié)構(gòu)不受影響，在pH4～7范圍內(nèi)101min100%的結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和折疊性。類卵粘有9通過(guò)天冬酰胺殘基與抑牛胰26%α-螺旋，10%轉(zhuǎn)角，呈現(xiàn)高度有序性。、C、H，木瓜凝乳酶，番木瓜酶Ⅲ都具有抑作用。半胱氨酸酶抑劑與它抑的酶形成穩(wěn)固的合體，離解常數(shù)在10-8~10-12mol/L之間。半胱氨酸酶抑劑非常穩(wěn)定，pH1265℃加熱的析顯示二級(jí)結(jié)構(gòu)中有20%的α-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)?？股锼厥且环N糖，4個(gè)同的多肽亞基組成，能與生物素形word為10-15mol/L蛋白質(zhì)是動(dòng)物(人)生存所必須的日糧組分，其在營(yíng)養(yǎng)中的最基本功能是為機(jī)體供充(Essneati!amni()，有動(dòng)物(人)種EAA，白質(zhì)中氨基酸最、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的一種蛋白，常價(jià)其它物蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋清蛋白的化(人)在98%、蛋白質(zhì)(Netprotei和蛋白質(zhì)化(ProteindistibilicorrectedmainoacidSeore，PoeAAs)分為7111高(54.5%)、(76%)、(74.3%)和(74%)。一合的對(duì)蛋是蛋品和生的。Stdaelmnna(1999)，在合價(jià)蛋是蛋有3。與產(chǎn)品[5]產(chǎn)品。:①熱干燥生蛋白片蛋清粉，品和化生;②通風(fēng)鞭打生空氣的輕質(zhì)蛋清品，蛋白與糖的混合物(meringues);③一(乙醇沉淀)生低卵粘蛋白但仍保持蛋清功能特性(鞭打性、起泡性等)的蛋醫(yī)word文檔 可自由復(fù)制編輯選用一些適宜的微物對(duì)雞蛋清進(jìn)行發(fā)酵，不僅蛋清飲料，還具有解(冷、熱)應(yīng)激所致的小鼠淋巴器官(胸腺和脾臟)萎縮回，提高嗜中性粒細(xì)胞的吞噬和殺菌活性，增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能，以及促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖。源性疾病的發(fā)。因此必須在連續(xù)監(jiān)控下液體蛋清，,既能殺滅中微色澤、香味、營(yíng)養(yǎng)成分及功能性質(zhì)。冷殺菌技術(shù)包括超高壓殺菌、高壓脈沖電場(chǎng)殺菌、脈沖強(qiáng)光殺菌、臭氧殺菌、膜分離殺菌、紫外線殺菌等。酶水解物些優(yōu)點(diǎn)使得蛋清水解物研究得到人們的重視。金嫘[5]、宿哲然[6]、孟祥晨[7]研究了蛋清酶解的工藝條件，張英君研究了酶解物的功能性質(zhì)[8]F值寡肽酶解物的備方法[9]Lee等用木瓜蛋白酶水解蛋清，得到的蛋清水解物的起泡能力和蛋糕體積指數(shù)都得到提高[10]。本課題研究目及意義在一定程度上改善其功能特性(,.word、,。實(shí)驗(yàn)清原料了酶解清適宜條件備清氧化主要研究?jī)?nèi)容：測(cè)定各酶力用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)酶力測(cè)定法測(cè)定了酶、堿酶等七酶力。篩選適合水解清酶通探討影響清水解氧化因素篩選出酶解清適宜酶。確定清水解備工藝條件設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)水解物得率、水解度、氧化確定酶解清最佳工藝條件。word與方法主要與試劑蛋 s） s） s） s） ） A） ） 酸 納 一廠無(wú)水硫銅 無(wú)水碳鈉 氫氧納 心無(wú)水醇 茚酮 國(guó)藥集團(tuán)濃鹽酸 黑龍江省雙城鑫田造羥甲基氨基甲烷 北京磷氫二鈉 西安廠磷二氫鈉 北京雙環(huán)廠EDTA 濱金麗工儀器與設(shè)備UV757CRT紫外見光光度計(jì) 722見光光度計(jì) 電熱恒溫水浴鍋 廠指針式電熱恒溫水浴鍋 廠電子平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)wordTDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器電熱恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠水浴恒溫震蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠超聲脫氣儀 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠LG10-2.4A型高速臺(tái)式離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械海爾冰箱 中國(guó)青島海爾有限公司主要試劑的配制磷酸緩沖溶液(pH7.5)稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12HO)3.01g，磷酸二氫鈉(NaH2PO4?2HO) 0.25g混2 2合，加水溶解并定容至500ml。2.三氯乙酸0.4mol/L65.4g1000ml。3.0.4mol/L稱取無(wú)水碳酸鈉粉42.4g1000ml。4.氫0.5mol/L稱取氫2g100ml。5.溶液稱取性酸3入pH7.2100ml，溶液冰箱，有三天。6.L-酸100μg/ml5℃干燥至恒重,0.00021mol/L60ml溶解100ml，即1mg/ml酸溶液。吸取1mg/ml酸溶液用鹽酸定容至100ml，100μg/ml酸溶液。word文檔 可自由復(fù)制編輯福林試劑的制備2于l 磨口回流裝置中加入鎢酸鈉（2W42H2

O）100g、鉬酸鈉2O4H2l、50ml100m10，(Li2SO4)50g、水50ml和數(shù)滴濃溴水(99%),在微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有綠色需再加溴水，再煮沸出去過(guò)量的溴，冷卻，加水定容至1000ml?；靹?，過(guò)濾。制得的試劑應(yīng)呈金黃色，貯存于棕色瓶?jī)?nèi)。使用溶液:一份福林試劑與一份水混合，搖勻。-酚甲液B100ml1%的硫酸銅溶液。2.000g2%的酒石酸鉀納溶液1%2%1mlB液中，即得到福林-酚甲液。茚三酮顯色劑0.5，0.3、N2HP41022P46，用蒸餾水定容至100ml。10.量取40ml無(wú)水60ml40%溶液。鹽酸溶液(在通風(fēng)櫥中)量取4.5ml裝500ml定容至500ml，Tris-Hcl液（PH=8.2）量取50ml0.1mol/l三甲甲溶液，加入22.9ml0.1mol/l鹽酸，用蒸餾水定容至100ml。三甲甲溶液稱取0.6057g三甲甲溶液，用蒸餾水定容至50ml。三酚溶液稱取0.0378g，用10mmol/lHCL定容至100ml。酸備液量取15ul50ml0.2mol/l磷酸鹽液中，10000r/min10min，使溶液呈色，0℃保存，24小時(shí)內(nèi)使用。word文檔 可自由復(fù)制編輯FeCl2-EDTAl2gEDTA18.61000m。(0.3mol/LHCL)75ml%)。FeCl2lFecl29.95g500ml。40,100m40[11]pHn2-12-1準(zhǔn)溶液l/ml０0010１1028２2046３3064４4082５50100b1.00ml230.4mol/L5.00m1.00m400.浴中顯20minmm0A為縱坐C為橫坐此應(yīng)通過(guò)零點(diǎn)。②種wordm3123l0℃2minl10min后2.0mL的4%三氯乙酸溶終止反應(yīng)40℃水浴鍋中靜20min1.0mL濾過(guò)依次5.0mL0.4mol/LNa2C3溶1.0mL已的福林劑混合后4℃水浴中靜20min660nm波長(zhǎng)下以空白做參比測(cè)定吸光度?？瞻自诶业鞍兹芎偷扒迦芎笙热纫宜崛茉倜溉?次數(shù)據(jù)平均值。酶活的計(jì)算如下：40℃下分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1ug酪氨酸1個(gè)酶活力單位。蛋白酶活力單位（干基=

A 14N10 1WADD值；4——4ml反應(yīng)1ml測(cè)定（4倍）；N——酶10——10min；W——水分含量；K—吸光常數(shù)； [12]中的蛋白質(zhì)濃度。1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2-2配不同濃度的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液2-2準(zhǔn)溶液酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶的2l酸標(biāo)準(zhǔn)溶的體積mlml０001.0１400.20.8２800.40.6３1200.60.4４1600.80.2５2001.00上表酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶3mL福林-酚甲混合均勻25℃水浴鍋中靜10min。再0.3mL1mol/L福林-酚乙迅速混合25℃水浴鍋中靜30min后,以介質(zhì)溶word750nm0A為C。6m10min42ml30min4000r/min10minl0—-[13]1mL3mL-25℃10min再mL1mol/L-迅速25℃30min,750nm介溶00～60mg/L范圍內(nèi)呈良好性關(guān)系。利用回歸方程計(jì)算中多肽多肽得率

(g/m100%三酮比色[13](1)

(g/ml)0.1000g干燥甘氨溶容至l出l容至l得l2lll15min同時(shí)作試驗(yàn);放置15min用1cm比色杯，于570nmA值A(chǔ)甘氨C。2-3甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液號(hào)g顯色劑體積00114128131214161520162412lll1.00ml顯色劑置中熱15min.同時(shí)作試驗(yàn)wordNH2(μmol/ml)。Hμmol/m）DH[

62N(mg/m

3

mmo/g].143(mmo/g)10l）三酚自[14]SO.3ml0.1mlLl22.8ml210min然3mmol/L/Ll0.1mL混勻開始記時(shí)30s讀320,5min結(jié)束。照管以0.1ml0.1ml吸光度隨時(shí)間變回歸程其抑

V V 100%照式

----表示照速率照實(shí)驗(yàn)

V --- 表示速率工藝流程新鮮雞蛋→攪打→調(diào)配→熱處理→→解→2h→6ml→沸水浴p滅10min要點(diǎn)：攪打：從新鮮雞蛋離出蛋清10000r/min10min。調(diào)配：吸25ml蛋清50ml蒸餾水配4%蛋清熱處理：2mol/lNaOHpH=10.00,8530min。滅：蛋白時(shí)沸水浴滅氯乙30min；水解度和2mol/LHClpH=2.0滅不需氯乙沉淀。蛋清蛋白水解酶篩選以原蛋清原料蛋白水解篩選離出蛋清,n10min攪拌均勻蛋清液25ml50ml%、wordssg4h2LNaOHpH10min20min40min60minnl130min22mol/LHclpH=2.04000r/min10min1ml50n10min%的H530min風(fēng)味snovoymenovoymesg22mol/LNaOHpH60min6ml130min22Ll4000r/min10min1ml50n10min%的H530minsgh2mol/LNaOHpH10min20min40min60min120min6ml130min22Ll調(diào)pH=2.010min法同法同方法同。2-4 、水解條件商品名稱 質(zhì) ） 酶 0） 酶 55℃word）PH=7.0T=50℃）PH=7.0T=50℃合動(dòng)物PH=7.0T=50℃A）PH=7.0T=50℃堿十萬(wàn)單位）2.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)PH=8.5T=55℃單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：pH值25.0000g天然50ml2mol/lNaOH溶液調(diào)pH=10.008530minpH6.0、7.0、8.0、8.50.03g，0h0[S]=4%、[E]/[S]=1/100、t=2hpH6.0、7.、8.、8.。在水解過(guò)程連續(xù)滴加2mol/LNaOHpH5h6ml滅。其后操作2.3.3操作步驟。T25.0000g天然50ml2mol/lNaOH溶液調(diào)pH=10.008530minpH7.00.03g，分別置于4℃556℃、6℃水浴恒溫磁力攪拌50℃、[S]=4%、[E]/[S]=1/100、t=2hT0℃、4556℃。在水解過(guò)程2mol/LNaOHpH5h滅2.3.3操作步驟。底物濃度[S]25.0000g天然50ml、35ml2mol/lNaOH溶pH=10.008530minpH7.00.03g，500=[E]/[S]=1/100t=2h]%、%2mol/LNaOH維持pH5h6ml滅2.3.3操作步驟。4[E]/[S]25.0000g天然50ml2mol/lNaOH溶液調(diào)pH=10.008530minpH7.00.09g、0.06g、0.03g、0.020.01g5℃水浴恒溫磁力攪拌5pH=7.0=[S]=4%、t=2h[E]/[S]5、0、00、0）word2mol/LNaOHpH550ml2mol/lNaOHpH=10.005nH0g0恒20min40min1234h56780、T50[S]=4%、t=2h不變t20min、40min、1h、2h、3h、4h、5h、6、7、82mol/LNaOHpH5h6ml2.3.32.3.4 白初研究基礎(chǔ)上采正交實(shí)驗(yàn)最佳白工藝條件。word七種酶活力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.3-110

y=0.0091x+R=0.99790 20 40 60 80 100 酪氨酸濃度3-13.1.2 酶活力測(cè)定1：商品名稱風(fēng)味蛋白七種7178IU/g堿性蛋白中性蛋白合蛋白合蛋白（動(dòng)物）102511IU/g4511IU/g79511IU/g146511IU/g19289IU/g51289IU/gword[3]、水解度、抗氧化性為指標(biāo)進(jìn)行篩。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制福林-3-2值DO酪蛋白濃度(ug/ml)3-2福林-酚法標(biāo)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線3-3值DO甘氨酸濃度(ug/ml)3-3茚三酮比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線為料如3-4、3-5、3-6所示。word5 novozymes)novozymes)% / 5 novozymes)率得 FH-N-肽 GA)多5 )5 5/min3- 3-4s。novozymes)5 novozymes)3 5 % 3 novozymes)度 5 FH-N-解 GA)5水5)55 5/min3-5水度3-5水度逐漸后趨于平衡s水度。word6 novozymes)novozymes)值 novozymes)化 FH-N-抗氧 GA)抗6 相 )/min3-63-6s為原料的白水解酶的篩選1h,、水度、抗,如3-7、3-8、3-9、3-10所示。novozymes)GA)GA)% 率 novozymes)得肽 多 novozymes))3-7word71。12 合s)10 合龐博公司）8 合6% 動(dòng)物龐博公司）6DH 風(fēng)味D4 s)2 s)0 龐博公司）1h時(shí)間3對(duì)水度影響81hs。合novozymes)合FH-N-GA博公司)合動(dòng)物博公司)風(fēng)味novozymes)%度解 novozymes)水龐博公司)時(shí)間3-9對(duì)水度影響91hs。word0000化00對(duì)0 300 101

novozymes)GA))novozymes)novozymes))3-1001hss、水度、,如3-11、3-12、3-13所示。率2050

))050100150200mn3-113-11隨著增加而逐漸增s作用后更word)novozymes)%度解3211 1 2/min3-123-12s)3 novozymes)3值2氧抗2相11 1 2/min3-133-135℃處理30min失活變提高。word件的研究pH。pH多肽得率,3-14所示45435% 3率 5得肽多 15154 1pH值圖3-14pH多肽得率3-14pH=8.5時(shí)，多肽得率最大。pH度,3-13所示% 5率得肽14 1pH值圖3-15pH度word3-15pHpH=8.5pH,3-163337%36制333331 3 6 7pH值3-16pH3-16pH=7.0pH(℃)效果(℃)多肽得,3-1733%率得肽1多11 3 6 7（℃）3-17多肽得word3-1760℃時(shí)，最大。(℃)水解,如下3-18所示。98%度解水311 3（℃）3-18水解3-18水解大50℃時(shí)水解最大。(℃)抗氧化性,如下3-19所示。3% 3率制抑111 3（℃）3-19抗氧化性3-19抗氧化性大50℃時(shí)抗氧化性最大。word[s]%。[s]%多肽得率,3-20所示。3302%率/ 20率得肽多1000% 1% 2% 3% % % % %%圖3-20多肽得率圖3-20以看出，多肽得率很大，從4%增6%時(shí)，多肽得率顯著降低，當(dāng)[s]=4%時(shí)，多肽得率大。[s]%,3-21所示11210%度解水200% 1% 2% 3% % % % %%圖3-21word3-214%6%[s]=4%。[s]%抗氧化性,如下3-22所示3322%2率制抑% % 2% 3% % % % %%3-22不同抗氧化性3-22抗氧化性4%增6%抑率[s]=4%抑率。不同[E]/[S]效果。不同[E]/[S]多肽得率,如下3-23所示22%率得肽多% % 2% 3% % %/3-23不同加酶量多肽得率word3-23。3-22發(fā)現(xiàn)大不一定大[E]/[S]=1/100時(shí)最大。不同[E]/[S]水解度,如下3-24所示3252%5度解水55% % 2% 3% 4% 5%/3-24水解度3-24水解度很大。水解度隨增大而增大當(dāng)[E]/[S]=4/100時(shí)水解度最大。不同[E]/[S]抗氧化性,如下3-25所示54% 3率制抑2% % 2% 3% 4% 5%/3-25抗氧化性word3-25。抑率也隨增而增當(dāng)[E]/[S]=4/100時(shí)抑率最。不同解時(shí)間水解效果。不同解時(shí)間多肽得率,如下3-26所示%率得肽多2 3 6時(shí)間/min3-26 不同時(shí)間多肽得率3-261h內(nèi)多肽得率隨時(shí)間顯增隨著時(shí)間增多5h。,3-27所示。2%度解 水22 3 6時(shí)間/min3-27水解度word7hh5h。,3-283% /率222 3/min3-283-285h。p7.8.[E]/[s]%h。龐博公司）水解蛋清蛋白的最佳工藝條件pHT[s][E]/[s]和最佳工藝平和結(jié)果3-2、3-3。word3-2交因素水平表pHT(℃)[S][E]/[S]17.5503%2/10028.0554%3/10038.5605%4/1003-3復(fù)合白（動(dòng)物）水白影響因素交實(shí)驗(yàn)結(jié)果ABCD實(shí)驗(yàn)號(hào)PH值溫度(℃)[s]%[E]/[S]水解度/%抑率17.55032/1000.2191466130.431227.55543/1000.10383