基因表達(dá)的定量檢測分析

基因表達(dá)的定量檢測分析當(dāng)前1頁，總共40頁?；虮磉_(dá)的定量檢測方法1.蛋白表達(dá)水平的檢測：1）定量檢測分析：westernblotting、ELISA、HPLC2）蛋白質(zhì)功能分析：

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析：免疫熒光技術(shù)

蛋白相互作用研究：酵母雙雜交、免疫共沉淀（IP）、

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

酶活性檢測：ELISA、HPLC2.mRNA表達(dá)水平檢測：1）半定量RT-PCR2）Northernblot

3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RealtimePCR）

當(dāng)前2頁，總共40頁。Northernblot雜交

是用來檢測真核生物RNA的表達(dá)量和大小，以估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法，可以從大量的RNA樣本同時(shí)獲得這些信息。其基本步驟包括：1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進(jìn)行分離3.將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物（尼龍膜）上，在轉(zhuǎn)移的過程中，

要保持RNA在凝膠中的相對分布4.將RNA固定到支持物上（UV交聯(lián)）5.固相RNA與探針分子（DNA或RNA）雜交6.除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子7.對特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測、捕獲和分析當(dāng)前3頁，總共40頁。RealtimePCR當(dāng)前4頁，總共40頁。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。當(dāng)前5頁，總共40頁。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測。當(dāng)前6頁，總共40頁。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：

熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。當(dāng)前7頁，總共40頁。

在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。

而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。

只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和

CT值。

熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）當(dāng)前8頁，總共40頁。幾個(gè)常用名詞概念1.Ct值的定義

C代表Cycle，t代表threshold（閾值，臨界值），Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。當(dāng)前9頁，總共40頁。2.熒光域值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-153.Ct值與起始模板的關(guān)系

研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。當(dāng)前10頁，總共40頁。前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的

最初階段當(dāng)前11頁，總共40頁。絕對定量分析：

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系當(dāng)前12頁，總共40頁。質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用當(dāng)前13頁，總共40頁。當(dāng)前14頁，總共40頁。相對定量分析必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進(jìn)行校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。管家基因：維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等當(dāng)前15頁，總共40頁。當(dāng)前16頁，總共40頁。當(dāng)前17頁，總共40頁。當(dāng)前18頁，總共40頁。當(dāng)前19頁，總共40頁。當(dāng)前20頁，總共40頁。當(dāng)前21頁，總共40頁。當(dāng)前22頁，總共40頁。當(dāng)前23頁，總共40頁。當(dāng)前24頁，總共40頁。優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜，使用方便，不用設(shè)計(jì)復(fù)雜的探針。缺點(diǎn)：無模板特異性，對引物特異性要求比較高，

不能進(jìn)行多重定量分析當(dāng)前25頁，總共40頁。當(dāng)前26頁，總共40頁。當(dāng)前27頁，總共40頁。TaqmanProbeMolecularBeacon背景熒光更低當(dāng)前28頁，總共40頁。反應(yīng)優(yōu)化反應(yīng)液組成、體積50ul絕對不必要20ul應(yīng)用廣，但成本高推薦10ul，但需要優(yōu)化引物與引物、引物與探針濃度配比4×4組合，50nm,300nm,600nm,900nm探針50nm,100nm,250nm

當(dāng)前29頁，總共40頁。qPCR一般使用二步PCR擴(kuò)增，在退火-延伸整合步驟結(jié)束時(shí)進(jìn)行信號(hào)檢測。當(dāng)PCR反映效率低時(shí)可以使用三步PCR擴(kuò)增。染料法可以在72℃延伸結(jié)束時(shí)檢測。探針法只能在退火結(jié)束時(shí)檢測。當(dāng)前30頁，總共40頁。