pet系統(tǒng)原核表達詳細總結(jié)

pet系統(tǒng)原核表達詳細總結(jié)第1頁/共32頁不依賴連接反應(yīng)的克隆方法（LIC）用LIC法制備的pET載體有不互補的單鏈粘端，與目的插入片段上相應(yīng)的粘端互補。擴增目的插入片段的引物5,端序列要與LIC載體互補。T4DNA聚合酶的3,-5,

外切酶活性經(jīng)短時間即可在插入片段上形成單鏈粘端。由制備好的插入片段和載體互相形成退化產(chǎn)物，這種方法十分快速高效且為定向克隆。pET載體上編碼的氨基酸序列可通過腸激酶或X因子去掉。第2頁/共32頁FunctionofT7PolymeraseThe3'?5'exonucleaseactivityofT4DNApolymeraseremovesnucleotidesuntilitencountersaresiduecorrespondingtothesingledNTPpresentinthereactionmix.Atthispointthe5'?3'polymeraseactivityoftheenzymecounteractstheexonucleaseactivitytoeffectivelypreventfurtherexcision.第3頁/共32頁pET載體pET載體最初是由Studier及其同事構(gòu)建。(StudierandMoffatt,1986;Rosenbergetal.,1987;Studieretal.,1990).

包括兩種載體——轉(zhuǎn)錄載體（用于表達本身含有核糖體結(jié)合位點和起始密碼子目的基因）和翻譯載體（載體上帶有核糖體結(jié)合位點）。一般來說，轉(zhuǎn)錄載體用于表達來自原核的基因，而翻譯載體表達真核基因。第4頁/共32頁抗生素抗性pET載體常用的兩種篩選標記是Ampr+和Knar+因為內(nèi)酰胺酶的消化和PH的降低，Ampr+的選擇性易于丟失。某種情況下使用Knar+更為有利。Ampr+和Knar+的另一個不同是兩種基因的轉(zhuǎn)錄方向不同。Ampr+位于T7啟動子下游，與其方向相同。除了pET5系列，T7轉(zhuǎn)錄終止序列位于內(nèi)酰胺酶基因前面，但是這個終止序列只有70%的有效性。因此，T7聚合酶能夠通讀，導致內(nèi)酰胺酶的積累。相反Knar+的轉(zhuǎn)錄方向與T7啟動子方向相反，誘導時并沒有Knar+基因的增加。第5頁/共32頁

用于克隆的宿主菌用于克隆的宿主菌通常是Novablue，JM109以及DH5a。這些菌株是rec-end-型，轉(zhuǎn)化效率高，且質(zhì)粒產(chǎn)量也高，適合用于保存帶有克隆目的基因的PET載體。第6頁/共32頁用于表達的宿主菌BL21(DE3)

基因型：F–ompThsdSB(rB–mB–)galdcm(DE3)無抗性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到帶有T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌中，即可開始產(chǎn)生蛋白了。這些菌株都是DE3溶原菌。噬菌體DE3是一種衍生噬菌體，帶有噬菌體21抗性區(qū)和lacI基因，lacUV5啟動子，以及T7RNA聚合酶基因。這一區(qū)段被插入int基因，因此阻止了DE3在沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出，一旦形成DE3溶原狀態(tài)，就只有受IPTG誘導的lacUV5啟動子指導T7RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄。第7頁/共32頁BL21(DE3)BL21(DE3)是應(yīng)用最廣泛的表達宿主菌。是lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶（純化過程可以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更加穩(wěn)定。因為BL21(DE3)對利福平敏感，如果有必要可以用利福平來限制宿主RNA和蛋白質(zhì)的背景合成。第8頁/共32頁應(yīng)該注意一些帶有T7啟動子的商業(yè)載體原則上可以用來表達，然而，只有T7啟動子而沒有額外的lac阻遏子基因的載體并不適合。這些載體上的多拷貝lac操縱子（用于藍白斑篩選）會結(jié)合lac抑制因子，使pet菌株中同樣受lac抑制因子控制的基因部分表達。。結(jié)果基本的T7RNA聚合酶活性升高，使目的基因的穩(wěn)定性受到影響。第9頁/共32頁lacUV5Promoter與野生型lac啟動子相比，控制T7RNA聚合酶表達的lacUV5啟動子對cAMP/CRP的刺激并不敏感。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)rDE3宿主菌在缺少葡萄糖的培養(yǎng)基生長到穩(wěn)定期時，cAMP同樣對lacUV5產(chǎn)生了去阻遏作用。盡管宿主菌長到穩(wěn)定期并不推薦，菌體培養(yǎng)過夜（16h）后轉(zhuǎn)入含有1%的葡萄糖的培養(yǎng)基中，可以有效避免去阻遏作用，因為glucose可以cAMP的產(chǎn)生。第10頁/共32頁T7lacPromoterT7啟動子下游有個Lac啟動子，它包含常規(guī)的啟動子和lacI基因，T7lac與lacI啟動子位置交錯。采用這種載體及DE3溶原菌，lac阻遏蛋白可以作用與T7RNA聚合酶，也作用與載體T7lac啟動子。阻斷任何T7RNA聚合酶導致的目的基因轉(zhuǎn)錄。第11頁/共32頁pLysS和pLysE宿主菌另一個為目的基因提供穩(wěn)定性保證的方法是在擁有兼容的氯霉素抗性編碼表達少量T7溶菌酶（T7RNA聚合酶天然抑制物）的宿主中表達。T7RNA溶菌酶是一種雙功能蛋白，它能夠切割大腸桿菌細胞壁肽聚糖層，也可與聚合酶結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄。第12頁/共32頁pLysS(orpLysE）有助于目的蛋白的抽提ThepresenceofpLysS(orpLysE)hasthefurtheradvantageoffacilitatingthepreparationofcellextracts.Afterthetargetproteinhasaccumulated,thecellsarecollectedandsuspendedinabuffersuchas50mMTris-HCl,2mMEDTA,pH8.0.Simplyfreezingandthawing,oradding0.1%TritonX-100,willallowtheresidentT7lysozymetoefficientlylysethecells.ThispropertycanmakeitadvantageoustocarrypLysSinthecellevenwhenitisnotrequiredforstabilizingthetargetplasmid.第13頁/共32頁載體與宿主共同影響表達水平實際操作中，通常要嘗試多種不同的載體/宿主菌組合以期獲得擁有正確結(jié)構(gòu)的目的蛋白的高水平表達。第14頁/共32頁ThepETSystemProcessPreparepETVectorPrepareInsertDNACloneInsertintopETVectorTransformintoExpressionHost

InduceandOptimizeExpressionofTargetProteinScale-up

PurifyTargetProtein第15頁/共32頁PCR法制備插入片段有引入突變的風險，可以采用以下方法降低PCR反應(yīng)的突變：采用高保真的酶減少循環(huán)數(shù)增加模板濃度增加引物濃度第16頁/共32頁片段與載體連接ForastandardreactionusingDNAfragmentswith2–4basestickyends,use50-100ng(0.015–0.03pmol)ofpETvectorwith0.2pmolinsert(50ngofa500bpfragment)inavolumeof20μl.Assemblethefollowingcomponentsina1.5mltube(thesecomponentsareavailableseparatelyintheDNALigationKit,Cat.No.69838-3).Addtheligaselast.第17頁/共32頁接菌于LB液體培養(yǎng)基，搖過夜.取1.5ml于EP管，12,000g離心1min.徹底去除上清.用100ulsolutionI懸浮菌體.加200ul新鮮配制的0.2NNaOH,1%SDS，顛倒混勻，冰上放置3min.加150ul150μlofice-cold3MNaOAc,pH5.2。顛倒混勻，冰上放置5min。12000rpm，離心5min。轉(zhuǎn)移上清到一個新的Ep管。加400μlTE-bufferedphenol:chloroform:isoamylalcoho(25:24:1)，渦旋震蕩30s。12,000gfor5minat4°C.倒掉上清，加400ul乙醇。重懸沉淀，30ul含20ug/mlRNAse的TEbuffer。37°放置15min。

質(zhì)粒小量制備solutionI（ice-cold50mMglucose,25mMTris-HClpH8.0,10mMEDTA預冷）第18頁/共32頁表達宿主菌的誘導ForpETconstructionscarryingthe“plain”T7promoter,afinalconcentrationof0.4mMIPTGisrecommended,while1mMIPTGisrecommendedwithvectorshavingtheT7lacpromoter.An第19頁/共32頁準備誘導表達Pickasinglecolonyfromafreshlystreakedplateandinoculate50mlLBcontainingtheappropriateantibioticina250mlErlenmeyerflask.(Forgoodaeration,addmediumuptoonly20%ofthetotalflaskvolume.)第20頁/共32頁另一種誘導方法Alternatively,inoculateasinglecolonyorafewmicrolitersfromaglycerolstockinto2mlLBmediumcontainingtheappropriateantibiotic.Incubatewithshakingat37°CuntiltheOD600reaches0.6–1.0.Storethecultureat4°Covernight.Thefollowingmorning,collectthecellsbycentrifugation(30secinamicrocentrifuge).Resuspendthecellsin2mlfreshmediumplusantibioticandusethistoinoculate50mlmedium.第21頁/共32頁誘導的步驟37℃搖床培養(yǎng)到OD6000.4-0.1（建議OD600為0.6）約3個小時可達到.從中取出一些樣品作為未誘導對照及滴度測試。在剩下的樣品中加入100mMIPTG儲液至終濃度0.4（T7啟動子）或1mM（T7lac啟動子），繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。將搖瓶冰上放置5min，5000g4℃離心。如果需要收集上清進行進一步分析。重懸細胞于0.25倍體積預冷的20mMTris-Hcl（PH8.0）中離心。出去上清，菌體保存于-70℃冰箱或繼續(xù)純化。第22頁/共32頁優(yōu)化表達條件質(zhì)粒穩(wěn)定性測試平板1：10-6稀釋在瓊脂板。結(jié)果，所有細胞都生長。平板2：10-6稀釋在含抗生素平板。結(jié)果只有攜帶質(zhì)粒細胞生長。平板3：10-5稀釋在含IPTG平板。結(jié)果，只有質(zhì)粒已丟失或無法表達的目的基因的細胞能生長。平板4：10-5稀釋在含1mMIPTG和抗生素平板。結(jié)果，只有仍攜帶質(zhì)粒但已失去表達目的基因能力的細胞能生長。IPTG將阻止任何帶有T7RNA聚合酶誘導基因和功能目的質(zhì)粒的細胞形成菌落。III，IV不適用于pLysS，pLysE質(zhì)粒和T7lac啟動子。第23頁/共32頁優(yōu)化表達條件Theoptimalschemeandtimecourseforinductioncanvary,becausethecharacteristicsofeachtargetgeneproductareunique.Example：37℃生長常常會導致一些蛋白質(zhì)積累形成包涵體，而30℃生長則可能產(chǎn)生有活性的蛋白。如果想利用一些pET載體中的信號肽序列輸出蛋白的話，在25℃或30°生長和培養(yǎng)可能是最優(yōu)化的。在某些情況下，低溫（15℃-20℃）延長誘導時間（過夜）可以使溶解性蛋白產(chǎn)量達到最大。第24頁/共32頁優(yōu)化表達條件裂解緩沖液裂解緩沖液的性質(zhì)會大大影響到目的蛋白可溶與不溶之間的比例。當采用一般的裂解緩沖液如1×HisBindBinding（包括500mM）緩沖液時，一些包含疏水或膜相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白可能被歸于不容部分，但并不出現(xiàn)在包涵體中。在裂解緩沖液中加入毫摩爾的非離子型或雙性去污劑可以將由于細菌脂或膜結(jié)合而不容的蛋白組分轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇芙M分。BugBuster蛋白抽提試劑或PopCulture與rLysozyme一起使用，是使蛋白溶解的理想選擇。非離子型和雙性去污劑能夠溶解細胞壁和膜組分，因此，無需變性就可以釋放出胞內(nèi)蛋白。第25頁/共32頁優(yōu)化表達條件包涵體的形成有利于純化，因為：通過離心可以很容易的獲得高產(chǎn)量而且比較純的蛋白。包涵體的形成可以避免蛋白受到蛋白酶的降解。有毒蛋白以包涵體形式存在，可以避免其對細胞生長的抑制。近些年來，包涵體的解折疊的方法學上取得了很大的進步。報道了很多解折疊方案，不同的目的蛋白的解折疊方案不同，主要是根據(jù)經(jīng)驗來決定。蛋白質(zhì)解折疊試劑盒提供了一套試劑，能很方便的促進一些蛋白的重折疊。第26頁/共32頁優(yōu)化表達條件二硫鍵的形成pET-32,pET-39andpET-40溶解性可以通過選擇載體，克隆位點或是宿主菌來調(diào)控。例如，pET-32系列載體產(chǎn)生硫氧還蛋白的融合蛋白，可以增加胞質(zhì)中可溶蛋白的產(chǎn)量。AD494或BL21trxB菌株可以在胞質(zhì)中形成二硫鍵。Ifyourtargetproteincontainsoneormoreessentialdisulfidebonds,thecombinationofapET-32vectorandatrxB–hostmayprovetobeoptimalbecausedisulfidebondformationinthecytoplasmappearstobedependentonthepresenceofthioredoxins(Stewartetal.,1998).第27頁/共32頁優(yōu)化表達條件

蛋白質(zhì)在細胞周質(zhì)中易于形成二硫鍵，利于蛋白質(zhì)的折疊。與胞質(zhì)中不同，大腸桿菌細胞周質(zhì)是一個氧化的環(huán)境，含有催化二硫鍵形成的酶。要想得到正確折疊，有活性的含二硫鍵的目的蛋白，一個常用的策略就是，將異源蛋白運輸?shù)郊毎苜|(zhì)中。一般來說，通過目的基因與號肽基因融合，可以使表達蛋白定位于周質(zhì)。注意：過表達的DsbC酶是以氧化形式存在的，必須暴露在還原試劑中（0.1-1.0mMDTT）在體外才表現(xiàn)出二硫鍵異構(gòu)酶的活性。Typically,aDsbCfusionproteinexpressedfrompET-40b(+)isfirstpurifiedbyHis·Bindchromatography.Priortoexposingthefusionproteintoareducingagent,eitherEDTAshouldbeaddedtoafinalconcentrationof1mM,orthesampleshouldbedialyzedtoremoveresidualNi2+.第28頁/共32頁影響目標蛋白穩(wěn)定性的N端原則AnotherfactorthatappearstoinfluencetargetproteinstabilityistheaminoacidimmediatelyfollowingtheN-terminalmethionine(penultimateaminoacid).TheaminoacidatthispositiondeterminestheremovalofN-terminalfMet.Processingiscatalyzedbymethionylaminopeptidaseandisgovernedbythefollowingrelationship:thedegreeofremovaldecreasesasthesizeofthepenultimateaminoacidsidechainincreases(Hireletal.,1989;Lathopetal.,1992).Inpractice,littleornoprocessingwasobservedbytheseauthorswhenthefollowingaminoacidsoccupiedthepenultimate