選1微生物的實驗室培養(yǎng)

課題背景19世紀中期，關系到法國經(jīng)濟命脈的釀造業(yè)曾一度遭受毀滅性的打擊。在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經(jīng)過一番研究，法國科學家巴斯德發(fā)現(xiàn)導致生產(chǎn)失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們意識到保持培養(yǎng)物純凈的重要性。防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應用微生物的前提。一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保無處不在的其他微生物無法混入。當前1頁，總共50頁。到目前為止，幾十項諾貝爾生理學和醫(yī)學獎，化學獎都與微生物學有關當前2頁，總共50頁。微生物的類群原生生物(如草履蟲、衣藻等)原核生物(細菌、藍藻等)真菌(如酵母菌、霉菌等)病毒微生物包含了除植物界和動物界以外的所有生物。無細胞結構真核細胞原核細胞微生物:結構簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.且體內一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.當前3頁，總共50頁。1、提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件2、確保其它微生物無法混入實驗室培養(yǎng)微生物條件——培養(yǎng)基——無菌技術當前4頁，總共50頁。1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機鹽⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、尿素等注：含C、H、O、N的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源一、培養(yǎng)基人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成:碳源、氮源、水、無機鹽＋特殊營養(yǎng)物質牛肉膏又稱牛肉浸膏，是采用新鮮牛肉經(jīng)過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色。

蛋白胨是肉類等蛋白質經(jīng)酸、堿或蛋白酶分解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。蛋白胨富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類。它可以作為微生物培養(yǎng)基的主要原料，一般來說，用于蛋白胨生產(chǎn)的蛋白包括動物蛋白（酪蛋白、肉類）、植物蛋白（豆類）、微生物蛋白（酵母）等三種。能為微生物提供C源、N源、生長因子等營養(yǎng)物質。

當前5頁，總共50頁。⑶無機鹽Ca、K、Mg為大量元素，以無機鹽陽離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸鹽。Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培養(yǎng)中有0.1PPM就可以了，自來水原料中已夠用，不需另加。⑷水是細胞中生化反應的良好介質；營養(yǎng)物質和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水里，才能被吸收或排出體（細胞）外。水的比熱高，能有效的吸收代謝過程中放出的熱量，不致使細胞的溫度驟然上升。維持細胞的膨壓（控制細胞形態(tài)）。當前6頁，總共50頁。2.特殊營養(yǎng)物質：維生素、氨基酸、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、氧氣、滲透壓等的需求：例如:生長因子(即微生物生長繁殖所必需的，而自身不能合成（或合成能力有限）的化合物。如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)當前7頁，總共50頁。①按化學成分不同分：天然培養(yǎng)基/合成培養(yǎng)基4.培養(yǎng)基的種類種類化學成分是否明確用途天然培養(yǎng)基（如馬鈴薯、玉米粉等）否主要用于工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基（化學藥品）是分類、鑒定當前8頁，總共50頁。4.培養(yǎng)基的種類固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無凝固劑瓊脂②按物理狀態(tài)不同劃分:種類是否含凝固劑用途固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基是（1.5%-2.5%）是（0.2%-0.7%否分離、計數(shù)、鑒定等觀察微生物的運動、保存菌種等擴大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)瓊脂：一種從紅藻中提取的多糖。在980C以上熔化，在440C以下凝固，在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈固態(tài)。當前9頁，總共50頁。固體培養(yǎng)基：觀察菌落、鑒定、分離和計數(shù)劃線法、稀釋涂布分離法當前10頁，總共50頁。半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)觀察微生物運動、保存菌種當前11頁，總共50頁。液體培養(yǎng)基表面生長均勻混濁生長沉淀生長當前12頁，總共50頁。鑒別培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品。用以菌種的鑒別。4.培養(yǎng)基的種類③按用途不同劃分:當前13頁，總共50頁。在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌。如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。鑒別培養(yǎng)基伊紅和美藍培養(yǎng)基大腸桿菌伊紅和美藍培養(yǎng)基菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤代謝產(chǎn)物例：當前14頁，總共50頁。選擇培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入（缺少）某種化學物質,以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長。用以菌種的分離。4.培養(yǎng)基的種類鑒別培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品。用以菌種的鑒別。③按用途不同劃分:例：大腸桿菌伊紅和美藍培養(yǎng)基菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤代謝產(chǎn)物當前15頁，總共50頁。利用拓印法選擇出沒有抗氨芐青霉素能力的細菌。培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落選擇出沒有抗氨芐青霉素能力的細菌選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基+氨芐青霉素培養(yǎng)基沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出沒有抗氨芐青霉素能力的細菌?當前16頁，總共50頁。加入青霉素的培養(yǎng)基：加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基：不加氮源的無氮培養(yǎng)基：不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基：分離出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能殺死細菌、放線菌)分離出金黃色葡萄球菌（高濃度食鹽能殺死多種微生物）分離出固氮菌（非固氮菌因缺少氮源被淘汰）

分離出自養(yǎng)型微生物（異養(yǎng)微生物因缺少有機物被淘汰）以下選擇培養(yǎng)基可以分離的微生物？當前17頁，總共50頁。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。分析營養(yǎng)構成？培養(yǎng)基組分提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g蛋白胨10gNacl5gH2O定容至1000ml瓊脂20.0g1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方碳源、氮源、磷酸鹽和維生素氫元素、氧元素無機鹽碳源、氮源和維生素凝固劑當前18頁，總共50頁。2.無菌范圍：實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具滅菌實驗操作過程:酒精燈火焰旁操作超凈工作臺二、無菌技術泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。防止外來雜菌的污染1.無菌的意義：當前19頁，總共50頁。二、無菌技術消毒：用溫和的化學或物理方法，殺死物體表面或內部的部分微生物(不包括芽孢、孢子）的過程。3.無菌的方法：滅菌：以強烈的理化因素殺死物體內外所有微生物（包括芽孢、孢子）

，達到完全無菌的過程。泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。滅菌與消毒技術是微生物有關工作中最普通也是最重要的技術。消毒與滅菌芽孢有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。

芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌。孢子細菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的無性生殖細胞。能直接發(fā)育成新個體。當前20頁，總共50頁。(1)消毒的方法：①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min②巴氏消毒法：(低溫消毒法，是一種利用較低的溫度既可殺死病菌又能保持物品中營養(yǎng)物質風味不變的消毒法,現(xiàn)在常常被廣義地用于定義需要殺死各種病原菌的熱處理方法)70-75℃下煮30min或80℃下煮15min③化學藥劑消毒法：用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源④紫外線消毒：對實驗室空氣消毒當前21頁，總共50頁。①灼燒滅菌：微生物學實驗室的接種環(huán)、接種針、試管口等的滅菌(2)滅菌的方法：當前22頁，總共50頁。②干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。適用于玻璃器皿(如試管、培養(yǎng)皿、吸管、注射器)和金屬器具(如針頭、鑷子、剪刀等)的滅菌。

(2)滅菌的方法：當前23頁，總共50頁。③高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。(2)滅菌的方法：當前24頁，總共50頁。類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體70～75℃煮30min或80℃煮15min化學藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線房間、儀器設備紫外線照射30min灼燒滅菌接種工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱1～2h高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等,生產(chǎn)和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa,溫度121℃,15～30min3.無菌的方法：消毒與滅菌當前25頁，總共50頁。1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿。

。（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管。

。（3）實驗操作者的雙手。

。答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。旁欄思考滅菌滅菌消毒3.使用后的培養(yǎng)基丟棄前應怎樣處理？使用后的培養(yǎng)基丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。當前26頁，總共50頁。微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存三、實驗操作大腸桿菌的純化培養(yǎng)㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌例如：當前27頁，總共50頁。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂、攪拌→補水定容4.調pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：加棉塞、包牛皮紙、橡皮筋勒緊培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，培養(yǎng)皿干熱滅菌㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計算稱量溶化調節(jié)pH滅菌倒平板無菌檢查當前28頁，總共50頁。計算稱量溶化調節(jié)pH滅菌倒平板無菌檢查12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3.用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上皿蓋。4.等待平板冷卻凝固（約需5～10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。1.將培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。倒平板注意事項：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基7.無菌檢查：37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h

，無雜菌污染才可用來接種.

培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻到什么時候，才能用來倒平板？約50℃為什么這樣操作？為什么平板需倒置？當前29頁，總共50頁。1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。答：將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。3.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？當前30頁，總共50頁。單個細胞單個菌落從混雜的微生物群體中獲得只含某一種微生物的過程。何為分離純化？如何純化？什么是菌落？微生物群分散或稀釋（二）純化大腸桿菌

原理：在培養(yǎng)基上，將細菌分散或稀釋成單個細胞，使其長成單個菌落。當前31頁，總共50頁。單個或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：菌落鑒定菌種的重要依據(jù)（微生物的菌落特征因種而異）

固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細胞群體當前32頁，總共50頁。單個細胞單個菌落從混雜的微生物群體中獲得只含某一種微生物的過程。何為分離純化？如何純化？平板劃線法如何分散成單個細胞？稀釋涂布平板法微生物群分散或稀釋（二）純化大腸桿菌

原理：

接種方法（純化方法）在培養(yǎng)基上，將細菌分散或稀釋成單個細胞，使其長成單個菌落。當前33頁，總共50頁。分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法（1）概念與原理：聚集的菌群連續(xù)劃線稀釋分散單個細胞單個菌落生長繁殖1、平板劃線法當前34頁，總共50頁。(2)“平板劃線”實驗操作1、將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。2、在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞3、將試管口通過火焰.4、將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，蘸取一環(huán)菌液.5、將試管通過火焰，并塞上棉塞.6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。7、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。8、將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。劃3個平板（重復實驗）1個不劃線（空白對照）1）一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；2）存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。當前35頁，總共50頁。第1區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第2區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第3區(qū)劃線接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌分區(qū)劃線法12345①接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.②劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環(huán)進行滅菌④劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)平板劃線法注意事項:當前36頁，總共50頁。（1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時,仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個細胞殺死接種環(huán)上原有微生物問題討論灼燒時期目的取菌種前每次劃線前接種結束后當前37頁，總共50頁。（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。（3）在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。問題討論當前38頁，總共50頁。3個劃線平板1個不劃線平板（重復實驗）（空白對照）（3）培養(yǎng)放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h當前39頁，總共50頁。①系列稀釋操作：②涂布平板操作：(1)概念與原理：聚集的微生物單個細胞菌液梯度稀釋單個菌落涂布平板(2)操作：生長繁殖2、稀釋涂布平板法涂布器當前40頁，總共50頁。①系列梯度稀釋操作9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水注意：移液管需要經(jīng)過滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。當前41頁，總共50頁。1、將分別盛有9ml水的6支試管滅菌，并按101～106順序編號。2、用移液管吸取1ml菌液，注入101倍稀釋的試管中。使菌液與水充分混勻。依次類推，直至完成最后一支試管的稀釋。注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時，試管口和移液管應在離火焰1∽2cm處。微量移液器①系列梯度稀釋操作101102103104105106當前42頁，總共50頁。②涂布平板操作：1、將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中滴2、取少量稀釋液（不超過0.1ml），滴加到培養(yǎng)基表面灼3、將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8-10s。試涂4、用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使涂布均勻各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照當前43頁，總共50頁。各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h（3）培養(yǎng)當前44頁，總共50頁。課題1微生物的實驗室培養(yǎng)當前45頁，總共50頁。四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后