課2010生物素-親和素免疫放大技術(shù)

生物素-親和素放大技術(shù)

侯玨湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系Biotin-AvidinAmplificationTechnique掌握生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)﹡目的與要求：了解生物素的理化性質(zhì)與活化熟悉生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用概述:生物素、親和素的發(fā)現(xiàn)BiotinandAvidin20世紀(jì)30、40年代初發(fā)現(xiàn)了生物素(biotin)和親和素(avidin)1979年，Guesdon及其同事首先將生物素—親和素應(yīng)用于免疫組化技術(shù)中生物素－親合素系統(tǒng)(Biotin-AvidinSystem簡稱BAS)

生物素、親合素的結(jié)合:迅速、專一、穩(wěn)定一種新型的生物反應(yīng)放大系統(tǒng)以生物素和親和素具有的獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，結(jié)合二者又可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，并具有多級(jí)放大效應(yīng)，極大地提高分析測定的靈敏度第一節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)一、生物素（biontin，B）又稱維生素H，輔酶R

由卵黃和肝組織中提取，分子量244.31kD分子結(jié)構(gòu)

Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)，與親和素結(jié)合的主要部位

II環(huán)為噻吩環(huán)，末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后成為活化生物素I咪唑酮環(huán)

Ⅱ噻吩環(huán)

羧基生物素分子結(jié)構(gòu)活化生物素

生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團(tuán)的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)*生物素酰肼（BHZ）：水合肼+生物素用于標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基、巰基和糖基

生物素-N-羥基丁二酰亞胺酯BNHS（biotinyl-N-hydroxy-succinimideester）:長臂活化生物素BCNHS(N-hydroxy-succinimido-6-biotinylamidohexanoate)

標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基

生物素+N-羥基丁二酰亞胺生物素N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）N-(CH2)6-H6-氨基己糖BCNHS結(jié)構(gòu)式BNHS的結(jié)構(gòu)式*長臂活化生物素（BCNHS）生物素與親和素正常結(jié)合大分子造成空間位阻效應(yīng)長臂生物素克服位阻效應(yīng)標(biāo)記核酸

二、親和素（avidin，AV）

亦稱抗生物素蛋白、卵白素由卵白蛋白中提取，4個(gè)相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68kD每個(gè)親和素能結(jié)合4個(gè)分子的生物素，二者之間的親和力極強(qiáng)（結(jié)合常數(shù)10mol／L耐熱、耐受多種蛋白水解酶的作用，與生物素結(jié)合后，穩(wěn)定性更好

*生物素-親和素的結(jié)合特異性高、穩(wěn)定性好15

鏈霉親和素（streptavidin，SA）是由鏈霉親和素菌分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為65kD鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，結(jié)合生物素的活性基團(tuán)是肽鏈中色氨酸殘基一個(gè)鏈霉親和素分子也能結(jié)合4個(gè)生物素分子結(jié)構(gòu)

四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無糖基pI

10.56結(jié)合位

色氨酸色氨酸生物素

44Ka

10151015活性

13～1515～18親合素（A）鏈霉親合素(SA)AV：高pI、高含糖結(jié)構(gòu)非特異性顯色*目前常用鏈霉親合素來代替親合素第二節(jié)生物素或親和素標(biāo)記物的制備活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接,可用于標(biāo)記各種蛋白質(zhì),形成生物素化蛋白質(zhì)衍生物一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記-----多價(jià)性(高比活性)在與親和素的反應(yīng)中成為多價(jià)生物素化大分子的多價(jià)性，是BAS多級(jí)放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)

生物素化蛋白質(zhì)衍生物有二類:①生物素化的大分子生物活性物質(zhì)，如：抗原、抗體等②標(biāo)記材料結(jié)合生物素后制成的標(biāo)記物，如：酶類等

一、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)生物素標(biāo)記注意事項(xiàng)：①選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件②控制生物素：蛋白質(zhì)比例③在生物索與被標(biāo)記物間加入交聯(lián)臂樣結(jié)構(gòu)，利于結(jié)合④生物素與抗原、抗體等蛋白質(zhì)結(jié)合后應(yīng)不影響后者的免疫活性

（一）生物素化IgG的制備(IgG-biotinconjugate

，IgG/Biotin

)

原料：

BNHS+純化的IgG標(biāo)記原理：

BNHS分子中的-C＝O基團(tuán)---蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基的-NH2形成肽鍵，使IgG標(biāo)記上生物素。標(biāo)記過程:

標(biāo)記抗體/0.1M碳酸氫鈉緩沖液（pH9.5）BNHS/二甲基甲酰胺（DMF)常用濃度10mg/ml1:8(摩爾濃度比）

混合，攪拌4hr

透析24hr

保存?zhèn)溆?/p>

注意事項(xiàng)BNHS多標(biāo)記抗體,BHZ則多標(biāo)記酸性抗原；抗原、抗體標(biāo)記后活性不變；生物素化抗體應(yīng)避免反復(fù)凍融（二）生物素標(biāo)記辣根過氧化物酶的制備

原料：

BNHS+HRP（RZ>3.0)標(biāo)記原理：BNHS分子中的-C＝O基團(tuán)即蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基的-NH2形成肽鍵，使HRP標(biāo)記上生物素標(biāo)記過程:

HRP/0.1M碳酸氫鈉緩沖液（pH8.4）BNHS/二甲基甲酰胺（DMF)(常用濃度1mg/ml)

1:8(體積比）

混合，攪拌4hr

透析48hr

保存?zhèn)溆米⒁馐马?xiàng)勿用疊氮鈉防腐堿性磷酸酶標(biāo)記后活性將降低

二、親合素/鏈霉親合素標(biāo)記

鏈霉親和索（SA）因表面所帶正電荷少，且不含糖基，在實(shí)驗(yàn)中的非特異性結(jié)合遠(yuǎn)低于親和素，因此目前以鏈霉親和素標(biāo)記的酶結(jié)合物更為常用

HRP-SA結(jié)合物的制備：過碘酸鈉直接標(biāo)記原料：

SA+HRP（RZ>3.0)

標(biāo)記原理：ＨＲＰ-C-OH

ＨＲＰ-C＝O+SA-NH2

ＨＲＰ-CH2-NH2-SA

標(biāo)記過程:

活化HRP的制備

HRP/10mg/ml+NaIO4(60mmol/l４℃,20min

乙二醇４℃,30min

氧化HRP

過碘酸鈉HRP-SA的標(biāo)記與純化氧化HRPSA

混合

2hrKBH4終止反應(yīng)

透析

分離提純

HRP-SA結(jié)合物注意事項(xiàng)勿用疊氮鈉防腐第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)可以與多種大小分子結(jié)合結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用應(yīng)用類型：用于固相包被（或分離）用于標(biāo)記信號(hào)放大

一、應(yīng)用于固相載體的包被環(huán)節(jié)1.BAS用于固相化抗原/抗體的制備

(1)AV/SA先包被固相載體，利用生物素標(biāo)記待包被抗原/抗體，AV/SA-B反應(yīng)而使抗原/抗體固相化

(2)將生物素標(biāo)記的特異性抗體（抗原）和待測抗原（抗體）反應(yīng)后加入鏈霉親合素預(yù)包被的固相載體磁性微球，生物素-特異性抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合AV/SA先包被固相載體表面

?生物素—親和素系統(tǒng)基本類型有二種：生物素-親和素-生物素模式

BAB法：生物素標(biāo)記分子，以游離親和素為橋，分別連接抗原抗體系統(tǒng)和包含生物素化分子的信號(hào)檢測系統(tǒng)，稱為BAB法（bridged

biotin-avidin，BAB）；后在此基礎(chǔ)上發(fā)展了親和素－生物素化酶復(fù)合物技術(shù)，稱為ABC法（avidin-biotin-peroxidaescomplex，ABC）生物素-親和素模式

LAB法：直接用標(biāo)記親和素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測的BA法，或稱標(biāo)記親和素-生物素法（labelled

avidin-biotin，LAB）二、用于檢測系統(tǒng)的信號(hào)放大BAB法：也稱橋聯(lián)親和素-生物素法(BRAB)（bridgedavidin-biotinmethod

）BAB法原理示意圖EEEEEEEAg-Ab.B-A.B*ABC法：

⑴A+B·EA-B·E----------ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC

特點(diǎn)：將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC（預(yù)制AV/SAV-Biotin-E)ABCTECHNIQUEavidin-biotin-peroxidasecomplexA:AvidinB:BiotinP:PeroxidaseABC法原理示意圖EEEEEEEEEEABCTECHNIQUE間接法的ABC法AgPrimaryantibodyBiotinylatedSecondaryantibodyABCTECHNIQUE雙抗原夾心法的ABC法(ABC-ELISA)AgBiotinylatedprimaryantibodyLAB法：labelledavidin-biotinmethod

LBA法原理示意圖EEEEEEEEEAg-Ab.B-A*三、生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)靈敏度高

①形成的生物素衍生物，保持原有生物活性，具多價(jià)性②每個(gè)親和素分子有四個(gè)生物素結(jié)合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合生物素化的大分子衍生物和標(biāo)記物③具有多級(jí)放大作用，提高靈敏度特異性高①具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性②反應(yīng)試劑可高倍數(shù)稀釋，可明顯地降低或避免的非特異結(jié)合穩(wěn)定性強(qiáng)

①親和常數(shù)極高，解離常數(shù)很小，反應(yīng)不可逆②酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶以及有機(jī)溶劑均不影響其結(jié)合實(shí)用性強(qiáng)

①可與酶、熒光素和放射性核素等各類標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，用于檢測體液、組織或細(xì)胞中的抗原-抗體、激素-受體和核酸系統(tǒng)以及其他多種生物學(xué)反應(yīng)體系②可制成親和介質(zhì)，用于分離提純上述各反應(yīng)體系中的反應(yīng)物其他

①可制成多種通用性試