食品酶學(xué)本第四章固定化酶課件

第四章固定化酶一、固定化酶的概念二、固定化技術(shù)的興起與發(fā)展三、酶和菌體的固定化方法四、固定化酶的特性復(fù)習(xí)題3/16/20231一、固定化酶的概念固定化酶是指固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。示意圖酶的固定化是指通過某種方式將酶和水不溶性載體相結(jié)合，使酶被集中和限制，從而在使用時(shí)不再擴(kuò)散。固定化酶具有穩(wěn)定性增加、可反復(fù)使用并易于和產(chǎn)物分開等優(yōu)點(diǎn)，克服了游離酶的不足之處。固定化所用的酶可以是經(jīng)提取分離后得到的一定純度的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）或細(xì)胞碎片上的酶或酶系。相應(yīng)地，前者稱為固定化酶，后者稱為固定化菌體或固定化死細(xì)胞。可見，固定化菌體是固定化酶的一種形式，它不像固定化活細(xì)胞（或稱固定化增殖細(xì)胞）那樣，固定化菌體的細(xì)胞為死細(xì)胞，死細(xì)胞可以部分地起到載體的作用。

3/16/20232固定化酶示意圖水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)3/16/20233（一）生物催化劑—酶的顯著優(yōu)點(diǎn)酶是生物催化劑，它具有特異、高效、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少等顯著優(yōu)點(diǎn)，因而隨著酶學(xué)研究的不斷深入和酶工程的發(fā)展，工業(yè)化生產(chǎn)的酶越來越多，酶的應(yīng)用也越來越廣泛?，F(xiàn)在酶在食品、化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源和科研等各個(gè)領(lǐng)域已取得了顯著的成效。酶作為生物催化劑的許多優(yōu)點(diǎn)是任何無機(jī)催化劑無法比擬的。

3/16/20235（二）游離酶的不足之處（1）酶的穩(wěn)定性差，這是酶的最大的弱點(diǎn)。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，對酸、堿、熱、有機(jī)溶劑等條件易變性失活。（2）難于連續(xù)化生產(chǎn)。酶一般都是在水溶液中催化反應(yīng)，與底物和產(chǎn)物混合在反應(yīng)系統(tǒng)中，反應(yīng)后酶仍有較高的活力卻不易回收利用。這種一次性使用酶的方式，導(dǎo)致成本較高和難以連續(xù)化生產(chǎn)。（3）終產(chǎn)品的分離提純困難。由于酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給進(jìn)一步的分離純化帶來一定的困難。針對酶的以上不足，改善的方法之一就是固定化技術(shù)的應(yīng)用。

3/16/20236（三）固定化酶的發(fā)展簡史①1916年Nelson和Griffin就曾經(jīng)將轉(zhuǎn)化酶吸附在炭和氧化鋁上，并且證明這種吸附的酶（即固定化酶）具有活性。②1953年，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，經(jīng)重氮化法活化后，分別與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成了固定化酶。③1969年，日本的千畑一郎首次在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L—氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L—氨基酸，生產(chǎn)成本僅為游離酶生產(chǎn)成本的60%左右，他開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)的先例，是酶應(yīng)用史上的偉大變革。④1971年，召開第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議，確定了固定化酶的統(tǒng)一英文名為ImmobilizedEnzyme。⑤1973年，千畑一郎等人又采用固定化微生物細(xì)胞連續(xù)化生產(chǎn)L—天冬氨酸，后來又發(fā)展到固定化增殖細(xì)胞即固定化活細(xì)胞。3/16/20237酶固定化方法示意圖3/16/20239（一）吸附法概念：吸附法是指利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法。吸附劑：常用有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。特點(diǎn)：最大的優(yōu)點(diǎn)是廉價(jià)簡便、條件溫和酶活損失少；最大的缺點(diǎn)是酶易從載體上解吸附。

3/16/202310（二）包埋法概念：包埋法是指將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中而使酶固定化的方法。分類：據(jù)包埋劑和包埋方法不同，又可分為：①凝膠包埋法②半透膜包埋法特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，缺點(diǎn)是只適于底物和產(chǎn)物都是小分子的酶的固定化。

3/16/202311②半透膜包埋法半透膜包埋法是指將酶包埋在由各種高分子聚合形成的小球內(nèi)的方法。由于半透膜包埋法所形成的固定化酶小球的直徑一般只有幾微米到幾百微米，稱為微膠囊，所以，半透膜包埋法也稱為微膠囊包埋法。

3/16/202313（三）結(jié)合法概念：結(jié)合法是指通過離子鍵或共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合在一起而使酶固定化的方法。分類：①離子鍵結(jié)合法

②共價(jià)鍵結(jié)合法

3/16/202314①離子鍵結(jié)合法載體：常用的載體有DEAE—纖維素、TEAE—纖維素、DEAE—葡聚糖凝膠等離子交換劑。特點(diǎn)：與吸附法相似，具有酶活損失少、結(jié)合力弱等特點(diǎn)，在pH值和離子強(qiáng)度等條件改變時(shí)，酶易解吸，所以使用時(shí)需要嚴(yán)格控制pH值和離子強(qiáng)度等條件。

3/16/202315（四）交聯(lián)法概念：采用雙官能試劑將酶分子連接起來，從而使酶固定化的方法，稱為交聯(lián)法。雙官能試劑：常用的有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐和雙偶氮苯等。雙官能試劑分子中含有兩個(gè)官能團(tuán)，這兩個(gè)官能團(tuán)可與酶或蛋白質(zhì)的某些基團(tuán)反應(yīng)，從而使酶分子之間或蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)。應(yīng)用范圍：不僅適用固定化酶，也可用于固定化菌體。特點(diǎn)：用交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體，其最突出的特點(diǎn)是結(jié)合牢固而酶活損失大。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶活力的提高。雙重固定法：為了各方法之間可以取長補(bǔ)短，常采用雙重固定法，例如可將交聯(lián)法與一些物理性的方法（如吸附法、包埋法）聯(lián)合使用，從而制備出酶活損失少、結(jié)合牢固的固定化酶或固定化菌體。

3/16/202317（五）熱處理法概念：此法是用于菌體固定化的一種方法。它是將含酶的細(xì)胞直接進(jìn)行熱處理將酶固定在菌體內(nèi)從而獲得固定化菌體的方法。特點(diǎn)：菌體本身既是酶供體同時(shí)也是載體，所以方法簡便。但需注意的是，熱處理會引起酶的熱變性失活，因此，該法只適用于目標(biāo)酶熱穩(wěn)定性較好時(shí)，而且進(jìn)行熱處理時(shí)還需嚴(yán)格控制好熱處理強(qiáng)度，即嚴(yán)格把握加熱溫度和時(shí)間。熱處理法也可與其它固定化方法配合使用，進(jìn)行雙重固定化。

3/16/202318以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)（見表4-1）。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，常將兩種或數(shù)種固定化方法并用，以取長補(bǔ)短。各固定方法的特點(diǎn)與比較3/16/202319（一）固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)。顆粒和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，亦宜用于工業(yè)生產(chǎn)。3/16/202321（二）固定化酶的性質(zhì)酶在水溶液中以自由的游離狀態(tài)存在，但是固定后酶分子便從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y(jié)合于載體的狀態(tài)，其結(jié)果往往引起酶的性質(zhì)的改變。為此，在固定化酶的應(yīng)用過程中，必須了解固定化酶的性質(zhì)與游離酶之間的差別，并對操作條件加以適當(dāng)調(diào)整。由于固定化的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同。3/16/202322（三）酶活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合；②酶與載體結(jié)合時(shí)，其高級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變；③酶被固定化后，雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響。也有在個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游離酶活力高。3/16/202323（五）固定化酶的反應(yīng)特性固定化酶的反應(yīng)特性，均與游離酶有所不同。1、底物特異性固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關(guān)系。

（1）酶的底物為小分子化合物

（2）酶的底物為大分子化合物2、反應(yīng)的最適pH3、反應(yīng)的最適溫度4、米氏常數(shù)5、最大反應(yīng)速度3/16/202325（1）酶的底物為小分子化合物一般來說，當(dāng)酶的底物為小分子化合物時(shí)，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。例如，氨基?；?、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶等，固定化前后的底物特異性沒有變化。3/16/2023263、反應(yīng)的最適溫度固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高，如色氨酸酶經(jīng)共價(jià)結(jié)合后最適溫度比固定前提高5～15℃，但也有不變甚至降低的。固定化酶的作用最適溫度會受固定化方法以及固定化載體的影響。3/16/2023294、米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km反映了酶與底物的親和力。酶經(jīng)固定化后，酶蛋白分子的高級結(jié)構(gòu)的變化以及載體電荷的影響可導(dǎo)致底物和酶的親合力的變化。使用載體結(jié)合法制成的固定化酶Km有時(shí)變動(dòng)的原因，主