平面色譜技術(shù)03課件

5.平板色譜一般分離過程

將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流?dòng)相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動(dòng)，經(jīng)過試樣點(diǎn)時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)。紙層析和薄層層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用。比移值（R)：溶質(zhì)移動(dòng)距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比1）紙色譜載體：濾紙（纖維素），可吸附~22%水，其中~6%與纖維素上的羥基結(jié)合（通過氫鍵和分子之間的偶極作用）形成固定相紙~22%H2O~6%H2O固定相流動(dòng)相SSSSSSS紙色譜屬于分配色譜------正相和反相分配紙色譜2)薄層色譜

薄層

分離機(jī)制

主要應(yīng)用范圍

氧化鋁板吸附脂肪和芳香化合物、生物硅膠板吸附堿、甾類、萜類改性硅膠C2,C8,C18RP正相、反相非極性物質(zhì)、極性物質(zhì)CN板正相、反相農(nóng)藥、酚類、甾類NH2板正相、反相、核苷酸、農(nóng)藥、酚類、甾類、陰離子交換維生素類、嘌呤衍生物纖維素分配氨基酸、梭酸乙酰纖維素正相、反相蒽醌類、抗氧化劑離子交換劑陰、陽離子交換氨基酸、梭酸、氨基糖、肽聚酰胺分配黃酮類、酚類葡聚糖凝膠凝膠過濾蛋白質(zhì)、核苷酸活度級(jí)別含水量Ｗ％吸附力硅膠氧化鋁Ⅰ－－增強(qiáng)Ⅱ１０３Ⅲ１２６Ⅳ１５１０Ⅴ２０１５硅膠、氧化鋁活度、含水量與吸附力的關(guān)系不同溫度下硅膠表面硅醇基吸附水分子層的損失情況(3)粘合劑與添加劑①粘合劑

a.煅石膏（CaSO4·2H2O)：120~140℃烘烤2~4h,過200目篩，密閉備用。

b.羧甲基纖維素鈉（ＣＭＣ-Ｎa)：0.2~1.0%②添加劑

a.熒光指示劑ZnSO4:Mn254nm

ZnS·CdS:Ag366nm

b.酸、堿或緩沖液

c.硝酸銀溶液

Ｒ：飽合化合物炔烴反式烯烴順式烯烴(5)薄層板的活化

吸附劑的表面及其孔隙的表面存在許多活性點(diǎn)，活性點(diǎn)的強(qiáng)度和數(shù)目較大時(shí)，吸附劑的活度就高，吸附劑的保留能力也較高，被保留物質(zhì)R值就小。

①活化：105~120℃干燥0.5~1hⅡ~Ⅲ

級(jí)

②活度的標(biāo)定：

a.氧化鋁薄層活度的標(biāo)定染料溶液的配制：稱取偶氮苯30mg和對(duì)-甲氧基偶氮苯、蘇丹黃、蘇丹紅、對(duì)-氨基偶氮苯各20mg溶于四氯化碳50ml中，搖勻備用。標(biāo)定方法：取上述溶液20μl點(diǎn)于待測(cè)板上，用四氯化碳展開，測(cè)量五種染料的R

，由下表中確定薄板的花度級(jí)別。

染料活度級(jí)別（R值）ⅠⅡⅢⅣ偶氮苯0.590.740.850.95對(duì)-甲氧基偶氮苯0.160.490.690.89蘇丹黃0.010.250.570.78蘇丹紅0.000.100.330.56對(duì)-氨基偶氮苯0.000.030.080.19氧化鋁薄層的活度級(jí)別b.薄層活度的標(biāo)定染料溶液的配制：稱取對(duì)-二甲氨基偶氮苯、靛酚藍(lán)、蘇丹紅（蘇丹Ⅲ

）各20mg溶于1ml氯仿中，搖勻備用。標(biāo)定方法：取上述溶液點(diǎn)于待測(cè)板上，用正己烷-乙酸乙酯（9：1）展開，三種染料能分開，對(duì)-二甲氨基偶氮苯在前緣，靛酚藍(lán)在其次、蘇丹紅走在最后，這樣的硅膠活度與前述Ⅱ級(jí)氧化鋁的活度相當(dāng)。2）點(diǎn)樣：（1）樣品溶液的制備

①純品的溶解②樣品的提取與凈化

a.溶劑提取法b.液液萃取法c.液固萃取法-----親脂型和親水型固體萃取劑③溶劑的選擇

a.溶劑對(duì)溶質(zhì)的溶解度相對(duì)較小，否則會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)；

b.溶劑的粘度不宜太高，以便于點(diǎn)樣；

c.溶劑的沸點(diǎn)要適中。(2)點(diǎn)樣

①樣品濃度0.01~1.00%

②點(diǎn)樣體積經(jīng)典薄層1~5μl

高效薄層0.1~0.5μl

點(diǎn)樣過多會(huì)造成原點(diǎn)“超載”，展開劑產(chǎn)生“繞行”現(xiàn)象使斑點(diǎn)拖尾或重疊，嚴(yán)重影響分離。③點(diǎn)樣直徑經(jīng)典薄層<5mm(一般3mm)

高效薄層1~2mm

④點(diǎn)樣間距經(jīng)典薄層

1~2cm

高效薄層

<

0.5cm⑤點(diǎn)樣方法

a.點(diǎn)狀點(diǎn)樣b.帶狀點(diǎn)樣

c.自動(dòng)點(diǎn)樣d.接觸點(diǎn)樣接觸點(diǎn)樣示意圖③反圓心式展開展速快、可提高R值較大組分的檢測(cè)靈敏度和定量準(zhǔn)確性。④多次展開

a.單向多次展開

nR=1-(1-R)n

一般二次展開即可,能得到最佳的分離,但還不能使斑點(diǎn)十分濃集。

b.增量多次展開增量多次展開能提供比一般薄層色譜好得多的分離度，在短時(shí)間內(nèi)得到較多次展開，有利于斑點(diǎn)的濃集及R值較小的組分的分離。c.階式展開（分級(jí)展開）使用兩種或兩種以上極性不同的展開劑分別展開幾次，可以將極性相差很大的組分在一塊薄層板上分離。用乙醚-環(huán)己烷-甲醇（5：3：0.5）、乙醚-環(huán)己烷-甲醇（5：3：0.5）、甲苯-氯仿-甲醇-二乙胺（7：2：1：0.3）展開三次，在一塊薄層板上實(shí)現(xiàn)了11種異喹啉生物堿的分離。

在常規(guī)色譜中，僅在展開時(shí)出現(xiàn)一次斑點(diǎn)濃集。如重復(fù)展開n次，則最后斑點(diǎn)寬度降低到:(1-R)n×

起始寬度，但實(shí)際上沒有(1-R)n

那么明顯，主要是展開時(shí)又?jǐn)U散增寬，所以多次展開的優(yōu)點(diǎn)不是在斑點(diǎn)的寬度上，而是增加相鄰斑點(diǎn)的距離，并經(jīng)過一個(gè)最大值后再隨著繼續(xù)展開而降低。

對(duì)R

值低的斑點(diǎn)這種濃集更有效，這意味著對(duì)極性較大組分的分離效率及靈敏度的提高。b.蒸發(fā)展開當(dāng)展開劑前沿推進(jìn)到某一位置時(shí)，流入薄層的展開劑量恰好全部蒸發(fā)掉，此時(shí)處于穩(wěn)定態(tài)，溶劑必然成負(fù)速度梯度，因此蒸發(fā)展開的分離效果比普通展開方式為高，有利于R值小于0.3的組分的分離。蒸發(fā)展開示意圖(2)影響薄層展開的因素①相對(duì)濕度

a.預(yù)活化的薄層板可迅速吸附空氣中的水蒸氣，數(shù)分鐘內(nèi)可達(dá)平衡；

b.溶質(zhì)和溶劑極性的增加，展開時(shí)最佳相對(duì)濕度的范圍也相應(yīng)增大。

c.控制相對(duì)濕度的方法:硫酸溶液法、無機(jī)鹽溶液法②溶劑蒸氣的影響

a.展開室飽和b.預(yù)吸附c.吸附飽和d.毛細(xì)管飽和③溫度的影響溫度對(duì)分配色譜影響較大，對(duì)吸附色譜影響較小。④展距的影響展距增加一倍，分離度為原來的21/2倍。②展開劑的極性和強(qiáng)度

a.極性參數(shù)P′

混合溶劑的P′值

P′=ΦA(chǔ)PA+ΦBPB

PA、PB分別代表溶劑A和B的極性參數(shù)，ΦA(chǔ)和ΦB分別代表它們?cè)诨旌先軇┲械捏w積分?jǐn)?shù)。

A/B兩種溶劑組成的展開劑，當(dāng)用溶劑C去替換溶劑B并保持展開劑極性不變，則ΦC可按下式計(jì)算：

ΦC=ΦB（PB/PA）展開劑強(qiáng)度越強(qiáng),樣品組分k值越小，R值越大;反之亦然。b.強(qiáng)度參數(shù)（ε°：吸附層析，S：反相層析）溶劑在單位表面積的標(biāo)定活度的吸附劑上的吸附能。它是通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定的，以丙烷的ε°為零，其它溶劑的ε°與丙烷比較而求得的相對(duì)值。在硅膠上ε°與P′的關(guān)系曲線④展開劑的選擇原則：先找出一種極性或強(qiáng)度能使組分的k值在1~10（最好在0.5~5,或R值在0.65~0.17)之間，保持這個(gè)強(qiáng)度不變，改變展開劑的選擇性直到使組分有合適的分離度。

a.選擇展開劑的方法

a)三角形法

b)點(diǎn)滴試驗(yàn)法b.二元展開劑的極性和強(qiáng)度的選擇

二元展開劑由一種強(qiáng)度較大的溶劑（極性調(diào)節(jié)劑）和一種強(qiáng)度近于零的溶劑（底劑）按一定比例混合而成。乙醚-正己烷（50：50）P′=Φ乙醚P乙醚

+Φ正己烷P正己烷

=0.5×2.8+0.5×0=1.4

在乙醚-正己烷（50：50）中，分別用氯仿、二氯甲烷替代乙醚，其體積比為：

Φ氯仿=0.5×2.8/4.1=0.34Φ二氯甲烷=0.5×2.8/3.1=0.45

氯仿：正己烷（34：66）二氯甲烷：正己烷（45：55）為了使選擇性的差別達(dá)到最大，應(yīng)該從靠近三角形頂部的組中選擇強(qiáng)度較強(qiáng)的溶劑。c.二元展開劑的選擇性

二元展開劑選擇性的改變，主要是通過其中強(qiáng)度較強(qiáng)溶劑的組別的替換來實(shí)現(xiàn)的。d.其它因素

a)拖尾抑制劑

b)降低粘度和促溶作用

氯仿-甲醇-水、正丁醇-冰醋酸-水吸附層析法中的幾條規(guī)則：ε°增大則R值增大，但選擇性變?。沪拧銣p小則R值減小，但選擇性增大。二元展開劑中，當(dāng)強(qiáng)度較強(qiáng)的溶劑所占體積最大或最小時(shí)選擇性最大。當(dāng)展開劑的組成改變時(shí)，如果能引起溶劑分子和溶質(zhì)分子間的氫鍵作用的改變，則會(huì)產(chǎn)生最大的選擇性。如果用無水展開劑時(shí)組分斑點(diǎn)拖尾，則可選用去活性的吸附劑。4）定位和定性（1）光譜檢出法

紫外>0.5μg

熒光>0.01ng（2）蒸氣檢出法（3）試劑顯色法①顯色方法

a.噴霧顯色b.浸漬顯色c.超壓衍生化

d.展層-顯色法②顯色試劑

a.通用顯色劑

a)硫酸組成：硫酸-水（1:1），硫酸-甲醇或乙醇（1:1），1.5M硫酸與0.5~1.5M硫酸銨。方法：噴后110℃烤15min,不同有機(jī)物顯不同顏色。

b)0.5%碘的氯仿溶液

c)中性0.05%高錳酸鉀溶液易還原化合物在淡紅背景下顯黃斑。

d)5%磷鉬酸乙醇溶液方法：噴后120℃烘烤，還原化合物顯藍(lán)斑，再用氨氣熏，則背景變無色。b.專屬顯色劑（4）定性①斑點(diǎn)的R值②斑點(diǎn)的顯色特性③斑點(diǎn)的原位光譜掃描

a.薄層色譜-紫外可見光譜掃描

b.薄曾色譜-三維光譜掃描④與其它分析技術(shù)的聯(lián)用

a.與其它色譜法：GC、HPLC

b.與電化學(xué)法聯(lián)用：陽極伏安法、脈沖極譜法、庫侖滴定法

c.與光譜法聯(lián)用：原子吸收、拉曼光譜、IR、MS、NMR（５）定量

平板色譜簡(jiǎn)單、方便、及操作費(fèi)用低，可以在一塊層析板上同時(shí)展開多個(gè)試樣及將多條濾紙同時(shí)展開。采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進(jìn)一步改善分離效果。試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。３.平板色譜