微生物的實驗室培養(yǎng)課件

微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基礎(chǔ)知識當前1頁，總共60頁。病毒幾乎可以感染所有的細胞生物，并具有宿主特異性噬菌體植物病毒動物病毒微生物基礎(chǔ)知識當前2頁，總共60頁。病毒培養(yǎng)動物接種雞胚接種（常用的病毒培養(yǎng)法之一）組織培養(yǎng)（應(yīng)用最廣的方法）微生物基礎(chǔ)知識當前3頁，總共60頁。一、基礎(chǔ)知識：（一）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定等。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途當前4頁，總共60頁。培養(yǎng)基的種類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據(jù)物理性質(zhì)分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據(jù)化學成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基據(jù)用途分常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種用于微生物的分離、計數(shù)常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。當前5頁，總共60頁。固體培養(yǎng)基：菌落當前6頁，總共60頁。液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長當前7頁，總共60頁。半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)(是否運動)

當前8頁，總共60頁。2、培養(yǎng)基配制原則：

（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。（2）營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。細菌pH為：；放線菌pH為：；真菌pH為：。當前9頁，總共60頁。3、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。

當前10頁，總共60頁。4、微生物的五種營養(yǎng)要素碳源（carbonsource）

氮源（nitrogensource）

生長因子（growthfactor）

無機鹽（mineralsalts）

水（wahtor）

Cncnc-micro當前11頁，總共60頁。凡能為微生物提供生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為碳源。Cncnc-micro碳源當前12頁，總共60頁。C素構(gòu)成細胞及代謝產(chǎn)物的骨架C素是大多數(shù)微生物代謝所需的能量來源自養(yǎng)微生物以二氧化碳或碳酸鹽為唯一碳源進行代謝生長；異養(yǎng)微生物必須以有機物作為碳源進行代謝生長。碳源是異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì)。碳源功能當前13頁，總共60頁。無機C源：CO2、碳酸鹽，只能被自養(yǎng)微生物利用有機C源：各種糖類，其次是有機酸、醇類、脂類和烴類化合物碳源種類Cncnc-micro當前14頁，總共60頁。

凡是能為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為氮源。氮源Cncnc-micro當前15頁，總共60頁。

為微生物提供合成細胞物質(zhì)代謝產(chǎn)物的原料對許多微生物來說，既可利用無機態(tài)氮，也可利用有機態(tài)氮。

固氮微生物可以利用氮氣作為氮源進行生長。某些種類的氮源也能為微生物提供能量，如NH3既是硝化細菌的氮源又是能源，含C、H、O、N的蛋白質(zhì)等也能為微生物提供能量。氮源功能Cncnc-micro當前16頁，總共60頁。分子態(tài)氮：固氮微生物以分子氮為唯一氮源無機態(tài)氮：硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用有機態(tài)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物

a實驗室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源

b生產(chǎn)用玉米漿、豆餅、葵花餅、花生餅等氮源種類Cncnc-micro當前17頁，總共60頁。

構(gòu)成微生物細胞的組成成分調(diào)解微生物細胞的滲透壓，PH值和氧化還原電位有些無機鹽如S、Fe還可做為自養(yǎng)微生物的能源構(gòu)成酶活性基的組成成分，維持酶活性。Mg、Ca、K是多種酶的激活劑無機鹽無機鹽功能Cncnc-micro當前18頁，總共60頁。

構(gòu)成微生物細胞以C、H、O、N、P、S六種元素為主，約占細胞干重的95％以上；

Ca、K、Mg、Fe為大量元素，以無機鹽陽離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸鹽。

Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培養(yǎng)中有0.1PPM就可以了，自來水原料中已夠用，不需另加。無機鹽種類Cncnc-micro當前19頁，總共60頁。

微生物生長不可缺少的微量有機物質(zhì)叫生長因子。維生素

氨基酸堿基Cncnc-micro生長因子當前20頁，總共60頁。

有的微生物自己不能合成維生素，需要外加，主要是B族維生素、硫胺素、葉酸、泛酸、核黃素等，如生產(chǎn)味精需加生物素（是B族中的一種即VH）。維生素Cncnc-micro當前21頁，總共60頁。

有些微生物自己不能合成某種氨基酸，必須給予補充，如賴AA發(fā)酵所用的黃色短桿菌不能合成環(huán)絲AA，為環(huán)絲AA缺陷型菌株，在培養(yǎng)基中必須添加含環(huán)絲AA的氮源。如豆餅水解液或毛發(fā)水解液等。氨基酸Cncnc-micro當前22頁，總共60頁。

嘧啶和嘌呤是核酸和輔酶的重要組分，是許多微生物必須的生長因素。有些微生物不僅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能將補充的嘧啶和嘌呤結(jié)合在核苷酸上，還必須供給核苷酸，有的菌需補充卟啉或其衍生物，還有的菌需供給（低碳）脂肪酸等。堿基Cncnc-micro當前23頁，總共60頁。水Cncnc-micro

是細胞中生化反應(yīng)的良好介質(zhì)；營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水里，才能被吸收或排出體（細胞）外。水的比熱高，能有效的吸收代謝過程中放出的熱量，不致使細胞的溫度驟然上升。維持細胞的膨壓（控制細胞形態(tài)）。當前24頁，總共60頁。碳源、氮源、生長因子的比較來源常用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類構(gòu)成細胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物，有些還是做異養(yǎng)生物的主要能源物質(zhì)氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分當前25頁，總共60頁。選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導入了目的基因的受體細胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細胞當前26頁，總共60頁。

根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。合成培養(yǎng)基:當前27頁，總共60頁。天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;天然培養(yǎng)基：當前28頁，總共60頁。（二）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。當前29頁，總共60頁。

（１）消毒定義：利用化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

當前30頁，總共60頁。

（2）滅菌的定義：

是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括所有細菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌之過程。

滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。當前31頁，總共60頁。比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強烈全部微生物能消毒與滅菌的比較當前32頁，總共60頁。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精，氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法當前33頁，總共60頁。1、灼燒滅菌接種環(huán)、接種針、試管口2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：當前34頁，總共60頁。

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計的。

當前35頁，總共60頁。1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考當前36頁，總共60頁。3.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存當前37頁，總共60頁。三、實驗操作（一.）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）當前38頁，總共60頁。1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟當前39頁，總共60頁。8．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。當前40頁，總共60頁。倒平板技術(shù)當前41頁，總共60頁。1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。當前42頁，總共60頁。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。當前43頁，總共60頁。（二）、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)當前44頁，總共60頁。菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。當前45頁，總共60頁。菌落細菌的菌落特征因種而異當前46頁，總共60頁。霉菌的菌落特征因種而異菌落當前47頁，總共60頁。當前48頁，總共60頁。問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。當前49頁，總共60頁。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。當前50頁，總共60頁。當前51頁，總共60頁。當前52頁，總共60頁。問題討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。當前53頁，總共60頁。微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)當前54頁，總共60頁。四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。當前55頁，總共60頁。