微生物學(xué)基本操作技術(shù)演示文稿

微生物學(xué)基本操作技術(shù)演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共97頁(yè)。內(nèi)容微生物分類(lèi)微生物接種和培養(yǎng)微生物的分離微生物的鑒定微生物保藏質(zhì)控微生物當(dāng)前2頁(yè)，總共97頁(yè)。一、微生物分類(lèi)當(dāng)前3頁(yè)，總共97頁(yè)。一、微生物分類(lèi)-微生物的進(jìn)化和多樣性普遍性系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),親緣關(guān)系根據(jù)rRNA序列比較來(lái)決定。G.J.OlsenandC.R.Woese,‘RibosomalRNA:AkeytoPhylogeny’intheFASEBJournal,7:113-123,1993當(dāng)前4頁(yè)，總共97頁(yè)。一、微生物分類(lèi)原核生物大小:0.5-3mm形狀:-球型(Sthaphylococcus)-棒狀(Escherichiacoli)-螺旋(Rhodospirillum)生長(zhǎng)迅速，20min至幾小時(shí)可繁殖一代可利用多種碳源

真核生物細(xì)胞器：線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體液泡當(dāng)前5頁(yè)，總共97頁(yè)。一、微生物分類(lèi)procaryote.jpg當(dāng)前6頁(yè)，總共97頁(yè)。原核生物一、微生物分類(lèi)當(dāng)前7頁(yè)，總共97頁(yè)。真核生物一、微生物分類(lèi)當(dāng)前8頁(yè)，總共97頁(yè)。一、微生物分類(lèi)-多相分類(lèi)表征（表型）特征形態(tài)特征生理和代謝特征生態(tài)特征遺傳（基因型）特征蛋白質(zhì)比較核酸堿基組成核酸序列多相分類(lèi)PolyphasicTexonomyTechnology當(dāng)前9頁(yè)，總共97頁(yè)。一、微生物分類(lèi)-微生物的分類(lèi)等級(jí)“種”是微生物分類(lèi)中最基本的分類(lèi)單元?！胺N”的定義：一個(gè)種（基因型種）是有相似G+C組成并通過(guò)DNA雜交試驗(yàn)判斷由70%或更大相似性的菌株的集合。分類(lèi)等級(jí)界（Domain）門(mén)（Phylum）綱（Class）目（Order）科（Family）屬（Genus）種（Species）當(dāng)前10頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)當(dāng)前11頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)微生物接種定義將微生物的純種或含菌材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，這個(gè)操作過(guò)程叫微生物的接種。接種工具

微生物接種技術(shù)分類(lèi)斜面接種液體接種穿刺接種平板接種

當(dāng)前12頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)斜面接種左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平；右手先將棉塞（硅膠塞）擰轉(zhuǎn)松動(dòng)，再拿接種環(huán)；用右手的小指、無(wú)名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時(shí)將管口在火焰上灼燒；接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內(nèi)，冷卻、挑菌，轉(zhuǎn)入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。當(dāng)前13頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)當(dāng)前14頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)液體接種操作方法與斜面接種基本一致，只是將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時(shí)使接種環(huán)與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散；塞上棉塞，輕輕搖動(dòng)均勻；如果菌種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，使用移液管或滴管接種。當(dāng)前15頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)當(dāng)前16頁(yè)，總共97頁(yè)。三、微生物接種和培養(yǎng)穿刺接種用接種針調(diào)取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)（不要刺到底部），再沿原路拔出；此法用于厭氣性細(xì)菌接種，檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。當(dāng)前17頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)當(dāng)前18頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)平板接種平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計(jì)數(shù)等；平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面；斜面接平板：點(diǎn)種法、劃線法。當(dāng)前19頁(yè)，總共97頁(yè)。二、微生物接種和培養(yǎng)當(dāng)前20頁(yè)，總共97頁(yè)。三、微生物分離當(dāng)前21頁(yè)，總共97頁(yè)。微生物純培養(yǎng)分離技術(shù)純培養(yǎng)物是指來(lái)源于同一單細(xì)胞的細(xì)胞群體。獲得純培養(yǎng)物對(duì)微生物學(xué)研究至關(guān)重要。當(dāng)前22頁(yè)，總共97頁(yè)。微生物純培養(yǎng)分離技術(shù)涂布平板法平板劃線法平板傾注法稀釋搖管法液體培養(yǎng)基分離法單細(xì)胞（孢子）分離法選擇培養(yǎng)基分離法當(dāng)前23頁(yè)，總共97頁(yè)。涂布平板法1、少量樣品加到平板中央（0.1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻；4、無(wú)菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培養(yǎng)基表面，適當(dāng)條件下培養(yǎng)。當(dāng)前24頁(yè)，總共97頁(yè)。涂布平板法樣品需適當(dāng)稀釋30-300CFU/mL當(dāng)前25頁(yè)，總共97頁(yè)。平板劃線法斜線法曲線法方格法放射法四格法當(dāng)前26頁(yè)，總共97頁(yè)。平板劃線法斜線法：用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。當(dāng)前27頁(yè)，總共97頁(yè)。平板劃線法血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）當(dāng)前28頁(yè)，總共97頁(yè)。平板傾注法對(duì)起始樣品進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數(shù)的樣品與冷卻至適當(dāng)溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈豆?fàn)罨蛲哥R狀。當(dāng)前29頁(yè)，總共97頁(yè)。稀釋搖管法適合厭氧菌的純培養(yǎng)分離無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右梯度稀釋后的待分離菌株加入試管中搖勻、冷凝在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間當(dāng)前30頁(yè)，總共97頁(yè)。液體培養(yǎng)基分離不能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來(lái)獲得純培養(yǎng)。稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過(guò)95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。當(dāng)前31頁(yè)，總共97頁(yè)。單細(xì)胞（孢子）分離單細(xì)胞（或單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體。個(gè)體相對(duì)較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求。當(dāng)前32頁(yè)，總共97頁(yè)。選擇培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基特性促生長(zhǎng)能力抑制能力指示（鑒別）能力當(dāng)前33頁(yè)，總共97頁(yè)。選擇培養(yǎng)基分離傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基血平板：適于各類(lèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)，一般細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本的分離，都應(yīng)接種此平板。營(yíng)養(yǎng)肉湯：用于標(biāo)本及各類(lèi)細(xì)菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，適于接種疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標(biāo)本。中國(guó)藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板：可抑制G+細(xì)菌，有選擇地促進(jìn)G-菌生長(zhǎng)，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。麥康凱平板：具中等強(qiáng)度選擇性，抑菌力略強(qiáng)，有較少革蘭陰性菌不生長(zhǎng)。SS瓊脂：有較強(qiáng)的抑菌力，用于志賀菌和沙門(mén)菌的分離。堿性瓊脂：用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。當(dāng)前34頁(yè)，總共97頁(yè)。選擇培養(yǎng)基分離新型顯色培養(yǎng)基利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色的原理來(lái)檢測(cè)微生物的培養(yǎng)基。OrganismEnzymeSubstrateColorColiformsβ-galactosidaseX-GALBlueEscherichiacoliβ-galactosidase

β-Glucuronidase

MUGfluorescenceEscherichiacoliO157β-galactosidaseX-GALBlue當(dāng)前35頁(yè)，總共97頁(yè)。選擇培養(yǎng)基分離當(dāng)前36頁(yè)，總共97頁(yè)。基于酶與底物反應(yīng)的顯色培養(yǎng)基技術(shù)CHROMagar當(dāng)前37頁(yè)，總共97頁(yè)。Petrifilm3MAerobicCountPlateColiformCountPlateRapidColiformCountPlateE.coli/ColiformCountPlateEnterbacteriaceaeCountPlateYeastandMoldCountPlateStaph.aureusExpressCountPlateEnvironmentalListeriaPlate基于酶與底物反應(yīng)的顯色培養(yǎng)基技術(shù)當(dāng)前38頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定當(dāng)前39頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定多相鑒定（分類(lèi))（polyphasictaxonomy）是利用微生物從分子特性到生態(tài)特征的多種不同信息，綜合表型和基因型特征進(jìn)行微生物分類(lèi)鑒定的方法。當(dāng)前40頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-形態(tài)學(xué)觀察細(xì)菌酵母絲狀真菌宏觀形態(tài)（培養(yǎng)特征）將培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布，30℃培養(yǎng)16~24小時(shí)，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質(zhì)地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等。將培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，菌落質(zhì)地、菌落顏色、菌落表面是否為反光或暗淡、菌落是平伏還是隆起、菌落邊緣等。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（CA、CYA、WA）平板倒轉(zhuǎn)，向上接種三點(diǎn)，每個(gè)菌株接種兩個(gè)平板，倒置于

25℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)7天。觀察菌落直徑、顏色、質(zhì)地、滲出液、菌落反面顏色等特征。微觀形態(tài)（細(xì)胞特征）將培養(yǎng)物在30℃條件下培養(yǎng)16~24小時(shí)，挑取對(duì)數(shù)期的單菌落，涂布于事先滴加少量無(wú)菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進(jìn)行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小等細(xì)胞特征。培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和無(wú)性繁殖方式等。用無(wú)菌接種針挑取少量培養(yǎng)物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團(tuán)分散開(kāi)，蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、?；?、瓶梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子頭、分生孢子等。當(dāng)前41頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-形態(tài)學(xué)觀察當(dāng)前42頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-生理生化碳源和氮源運(yùn)動(dòng)性細(xì)胞壁組成滲透耐性能源氧關(guān)系發(fā)酵產(chǎn)物最適pH和生長(zhǎng)范圍一般營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型光合作用色素最適生長(zhǎng)溫度和范圍鹽需求及耐性發(fā)光次級(jí)代謝產(chǎn)物形成能量轉(zhuǎn)換機(jī)制對(duì)代謝抑制劑和抗生素的敏感性貯藏內(nèi)含物當(dāng)前43頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-生理生化Divisionbasedonmembranecomposition:a)gram-negative–haveouterandinnermembranesand athincellwall(Escherichiacoli)b)gram-positive–havenooutermembrane,buthavea thickercellwall(Bacillussubtilis)c)neithergram-norgram+-nocellwalls(mycoplasm):85/fox/gram-st.jpg:85/fox/bact-mem.jpg當(dāng)前44頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-生理生化API(bioMerieux)(biochemical)當(dāng)前45頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-生理生化BBLCrystal(BectonDickinson)將傳統(tǒng)的生化反應(yīng)、酶—底物呈色反應(yīng)與熒光增強(qiáng)顯色技術(shù)結(jié)合，設(shè)計(jì)鑒定反應(yīng)最佳組合。六類(lèi)鑒定試驗(yàn)板，可鑒定500種細(xì)菌當(dāng)前46頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-化學(xué)成分分析當(dāng)前47頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-基因型分析G+Cmol%16SrDNA,26SrDNAD1/D2,5.8SrDNAITSregion,β-tubulingene,calmodulingene,gyrAgene,pheSgene,recNgene,rpoBgeneandotherhousekeepinggenes.DNABarcodinggenesequenceanalysis,MultiLocusSequenceAnalysis(MLSA)DNA-DNA

hybridizationRAPD,RFLP,AFLP,SSCP,Eric-PCR,BOX-PCR,Rep-PCR,LAMP.當(dāng)前48頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-基因型分析DNA指紋圖譜分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCPERIC－PCR以細(xì)菌DNA中串聯(lián)重復(fù)序列為引物，通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，在不同種屬個(gè)體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，以電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，應(yīng)用于菌株分型。BOX-PCR根據(jù)BOX插入因子(大小為154bp,由保守性不同的boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)等亞單位組成)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增微生物基因組DNA的重復(fù)性片段,最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性。REP-PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù)DNA片段來(lái)獲得菌株特異性遺傳圖譜,其中重復(fù)DNA片段包含了一個(gè)高度保守的回文序列(REP)為38bp的片段,由1個(gè)保守回文段以及兩端分別有6個(gè)降解位點(diǎn)和1個(gè)5bp的可變框構(gòu)成。PCR-SSCP是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合，利用不同構(gòu)象單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動(dòng)速率的差異,檢測(cè)出DNA短片段中存在的單核苷酸突變,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種基因多態(tài)性的研究。。假絲酵母PCR-SSCP副溶血弧菌ERIC－PCR沙門(mén)氏菌REP-PCR當(dāng)前49頁(yè)，總共97頁(yè)。四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例116SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)當(dāng)前50頁(yè)，總共97頁(yè)。2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新種發(fā)表2008年ATCC16404鑒定為

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP將ATCC16404更名

2010年WDCM將ATCC16404更名

圖：ATCC16888和ATCC16404的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)a′nosVarga,Sa′ndorKocsube′,Bea′taTo′th,etal.Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistribution.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932圖:Rep-PCR條碼系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(DiversiLab平臺(tái))Figure2:DendrogramofRep-PCRBarcoding(DiversiLabPlatform).注：圖片來(lái)源于ReclassificationofATCC?16404TMandATCC?9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14表

ITS序列特殊位點(diǎn)堿基差異TableDifferenceofbasepositioninITSsequence四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前51頁(yè)，總共97頁(yè)。2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新種發(fā)表2008年ATCC16404鑒定為

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP將ATCC16404更名

2010年WDCM將ATCC16404更名

圖:基于曲霉黑色組β-微管蛋白基因序列的N-J樹(shù)Figure:Neighbour–joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri..注：圖片來(lái)源于Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistributionInternational.JournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932圖1:基于ITSDNA序列的黑色曲霉N-J樹(shù)Figure1:ANeighborJoiningTreeofBlackAspergillibasedonTheirITSDNASequences.注：圖片來(lái)源于ReclassificationofATCC?16404TMandATCC?9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前52頁(yè)，總共97頁(yè)。各種標(biāo)準(zhǔn)中仍將繼續(xù)采用ATCC16404作為質(zhì)控菌株。各類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F)98003)

,需要重新復(fù)核鑒定。黑曲霉？四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前53頁(yè)，總共97頁(yè)。形態(tài)學(xué)鑒定CYA培養(yǎng)基,25°C培養(yǎng)7dBiolog鑒定生長(zhǎng)濁度試驗(yàn)ITSrDNA區(qū)序列分析ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3β-微管蛋白基因序列分析Bt2a:5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3Bt2b:5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3反應(yīng)體系：100μL,10×擴(kuò)增緩沖液10μL;DNA模板1μL;dNTP(每種2.5mmol/L)8μL;引物(10μL/L)各2.5μL;TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)1.3μL;無(wú)菌超純水補(bǔ)足總體積100μL。反應(yīng)程序：94°C5min;94°C1min,55°C1min,72°C1min,30個(gè)循環(huán);72°C10min,4°C保存。四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前54頁(yè)，總共97頁(yè)。形態(tài)學(xué)鑒定圖

25°C培養(yǎng)7d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài)FigMacromorphologyandmicromorphologyon25°C,7d注:A菌落形態(tài);B:分生孢子梗形態(tài)(×100);C:分生孢子形態(tài)(×400).Note:A:Colonymorphology,B:Conidiophoremorphology(×100);C:Conidialmorphology(×400).該菌株的形態(tài)學(xué)特征符合黑曲霉A.niger的形態(tài)特征四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前55頁(yè)，總共97頁(yè)。Biolog鑒定注:?:沒(méi)有生長(zhǎng);+:生長(zhǎng)旺盛;w:微弱(邊界)生長(zhǎng);v:可變.Note:?:Nogrowth;+:Stronggrowth;w:Weakgrowth;v:Variedgrowth.表

碳源利用情況TableCarbonSourceUtilization碳源CarbonsourceATCC16888AspergillusnigerATCC16404AspergillusbrasiliensisCMCC(F)98003麥芽糖Maltose+?+β-甲基-D-葡萄糖苷β-Methyl-D-Glucoside+?+D-海藻糖D-Trehalose+?+L-蘋(píng)果酸L-MalicAcidv+?α-酮戊二酸α-Ketoglutaricacid?w?苦杏仁苷Amygdalin+?+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前56頁(yè)，總共97頁(yè)。ITSrDNA區(qū)序列分析圖

CMCC(F)98003的ITSrDNA區(qū)序列和β-微管蛋白基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果FigITSrDNAandβ-tubulingenePCRamplificationresultsofCMCC(F)98003注:M:DL2000marker;1:ITSrDNA區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果;2:β-微管蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果.Note:M:DL2000marker;1:ITSrDNAPCRamplificationresult;2:β-tubulingenePCRamplificationresult.表

ITS序列特殊位點(diǎn)堿基差異TableDifferenceofbasepositioninITSsequence堿基位點(diǎn)Baseposition140166172173AspergillusbrasiliensisIMI381727CCTCAspergillusnigerATCC16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個(gè)“C”為1位點(diǎn).Note:ThefirstCinthebordersequence(TTACCG)of18SandITS1isheredefinedasposition1.四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前57頁(yè)，總共97頁(yè)。ITSrDNA區(qū)序列分析以18S和ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個(gè)“C”為1位點(diǎn)。140166172、173四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前58頁(yè)，總共97頁(yè)。ITSrDNA區(qū)序列分析圖

基于ITS區(qū)rDNA序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)FigANeighborJoiningTreeofAspergillussectionNigri.basedonTheirITSDNASequences注:圖中發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值,圖例為遺傳距離.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003與與A.nigerATCC16888聚類(lèi)在分類(lèi)距離最近的一個(gè)分支上,序列相似性達(dá)100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性也具有很高的相似性,序列同源性均在98.6%?100%之間。四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前59頁(yè)，總共97頁(yè)。β-微管蛋白基因序列分析圖

基于β-微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)FigNeighbour-joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri注:圖中發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值,圖例為遺傳距離.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003與黑曲霉A.nigerCBS554.65T序列同源性為100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性均在94.7%以下。結(jié)合形態(tài)學(xué)、碳源利用情況和ITSrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結(jié)果,將CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉（Aspergillusniger

）。四、微生物鑒定-鑒定實(shí)例2當(dāng)前60頁(yè)，總共97頁(yè)。五、微生物保藏當(dāng)前61頁(yè)，總共97頁(yè)。菌種是進(jìn)行微生物學(xué)研究和應(yīng)用的基本材料，是發(fā)展生物工程的重要基礎(chǔ)條件之一，是國(guó)家的重要生物資源。菌種保藏管理要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。并對(duì)其所負(fù)責(zé)保藏的菌種均應(yīng)采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌種的污染或死亡。

《中國(guó)微生物菌種保藏管理?xiàng)l例》五、微生物保藏當(dāng)前62頁(yè)，總共97頁(yè)。制訂專門(mén)菌種保藏管理制度；同一株菌種采用兩種以上保藏方法保存；對(duì)只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個(gè)以上的保藏設(shè)備中；對(duì)菌種的入庫(kù)和出庫(kù)記錄入檔，實(shí)行雙人負(fù)責(zé)制管理；設(shè)專人負(fù)責(zé)管理菌種保藏設(shè)施正常運(yùn)行，定期檢修維護(hù)。五、微生物保藏當(dāng)前63頁(yè)，總共97頁(yè)。微生物菌種保藏方法基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境，使其長(zhǎng)期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性。基本措施是低溫、真空、干燥。五、微生物保藏當(dāng)前64頁(yè)，總共97頁(yè)。常用菌種保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍干燥法-80℃低溫凍結(jié)法液氮超低溫凍結(jié)法當(dāng)前65頁(yè)，總共97頁(yè)。定期移植法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間（3-6個(gè)月）進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：斜面制備接種培養(yǎng)保藏當(dāng)前66頁(yè)，總共97頁(yè)。

斜面制備培養(yǎng)基配制分裝滅菌擺放斜面當(dāng)前67頁(yè)，總共97頁(yè)。

接種當(dāng)前68頁(yè)，總共97頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)菌37℃，1-2d酵母28~30℃，2~3d絲狀真菌26℃，5~7d保藏4~6℃保藏3~6個(gè)月

培養(yǎng)和保藏當(dāng)前69頁(yè)，總共97頁(yè)。定期移植法操作簡(jiǎn)單，使用方便；對(duì)設(shè)備和人員要求不高；可隨時(shí)使用，便于觀察菌種；工作勞動(dòng)強(qiáng)度大，屬短期保藏，保藏成本高；菌種傳代頻繁，易退化、污染。當(dāng)前70頁(yè)，總共97頁(yè)。液體石蠟法指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。當(dāng)前71頁(yè)，總共97頁(yè)。

操作步驟：液體石蠟預(yù)處理斜面培養(yǎng)物制備灌注石蠟保藏優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟滅菌：

—121℃濕熱滅菌30min，蒸發(fā)水分；

—160℃干熱滅菌2h；冷卻至室溫。液面高出斜面頂部1cm4～6℃，干燥處；直立放置；保藏時(shí)間1～2年。當(dāng)前72頁(yè)，總共97頁(yè)。液體石蠟法操作簡(jiǎn)單，使用比較方便；對(duì)設(shè)備要求不高，對(duì)人員操作水平有一定要求；·菌種易退化、污染。當(dāng)前73頁(yè)，總共97頁(yè)。真空冷凍干燥法指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長(zhǎng)期菌種保存方法。當(dāng)前74頁(yè)，總共97頁(yè)。安瓿管的準(zhǔn)備清洗選用中性玻璃材質(zhì)的安瓿管；2%鹽酸浸泡8～10h，自來(lái)水沖洗至中性，蒸餾水沖洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；標(biāo)簽激光打印標(biāo)簽，標(biāo)明菌株編號(hào)和保藏日期，大小約10×20mm。噴碼于安瓿管外，160℃固定20min。滅菌

121℃，30min.當(dāng)前75頁(yè)，總共97頁(yè)。保護(hù)劑的準(zhǔn)備保護(hù)劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，2～5ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113℃滅菌20min；打開(kāi)放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30℃培養(yǎng)2天，無(wú)菌檢查合格后備用。

當(dāng)前76頁(yè)，總共97頁(yè)。凍干樣品制備制備斜面培養(yǎng)物；將保護(hù)劑用無(wú)菌吸管注入到斜面培養(yǎng)物上，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在保護(hù)劑內(nèi)。用長(zhǎng)毛細(xì)滴管將菌懸液分裝到安瓿管內(nèi)，0.1～0.2ml/管，操作時(shí)要把帶有菌懸液的長(zhǎng)毛細(xì)滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。當(dāng)前77頁(yè)，總共97頁(yè)。真空干燥

在開(kāi)動(dòng)真空泵后應(yīng)使真空度在15min內(nèi)達(dá)到66.5Pa，隨后逐漸達(dá)到26.6～13.3Pa，在此條件下，樣品將保持凍結(jié)狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進(jìn)行。終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時(shí)的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用1～2支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，當(dāng)其水分完全蒸發(fā)時(shí)視為干燥完結(jié)當(dāng)前78頁(yè)，總共97頁(yè)。預(yù)凍制備菌懸液、經(jīng)分裝到進(jìn)行預(yù)凍之間的時(shí)間不宜超過(guò)1h；分裝完成后將安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱預(yù)凍1h，使菌液完全凍結(jié)；可采用分段式預(yù)凍，先將分裝好的安瓿管置－20℃凍30分鐘，再放入－80℃冰箱凍30min；采用離心式凍干裝置時(shí)勿需預(yù)凍。當(dāng)前79頁(yè)，總共97頁(yè)。熔封

將安瓿管的中上部用火焰燒軟，拉成細(xì)頸；將安瓿管裝到多歧管上，用火焰在細(xì)頸處熔封；拉管時(shí)注意火焰不要離菌體太近。當(dāng)前80頁(yè)，總共97頁(yè)。真空度檢測(cè)

用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍(lán)光，說(shuō)明真空度符合要求。

當(dāng)前81頁(yè)，總共97頁(yè)。保藏

4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。

當(dāng)前82頁(yè)，總共97頁(yè)。真空冷凍干燥法保藏、運(yùn)輸方便；保藏時(shí)間長(zhǎng)(5～10年)；對(duì)設(shè)備要求高(真空冷凍干燥機(jī)、多歧管)，對(duì)人員操作水平要求高；冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。當(dāng)前83頁(yè)，總共97頁(yè)。-80℃冰箱凍結(jié)法將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)保存的一種長(zhǎng)期菌種保藏方法。準(zhǔn)備冷凍管準(zhǔn)備保護(hù)劑（10%-15%甘油）準(zhǔn)備菌懸液（細(xì)胞、孢子或芽孢懸液）制備冷凍管（取菌懸液和保護(hù)劑至冷凍管）保藏（-80℃，2～5年）當(dāng)前84頁(yè)，總共97頁(yè)。Microbank當(dāng)前85頁(yè)，總共97頁(yè)。-80℃冰箱凍結(jié)法使用方便；保藏時(shí)間較長(zhǎng)；對(duì)設(shè)備要求高(-80℃冰箱)；運(yùn)輸不方便。當(dāng)前86頁(yè)，總共97頁(yè)。液氮超低溫凍結(jié)法指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長(zhǎng)期菌種保藏方法。當(dāng)前87頁(yè)，總共97頁(yè)。操作步驟冷凍管準(zhǔn)備保護(hù)劑制備保藏培養(yǎng)物準(zhǔn)備預(yù)凍

—

將程序降溫系統(tǒng)預(yù)冷到4℃，將制備好的冷凍管放入其中，以1℃/min降溫速率降至-35℃；

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使用程序降溫盒。保藏

將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀?-150℃)或液相(-196℃)。同“－80℃冰箱凍結(jié)法”

當(dāng)前88頁(yè)，總共97頁(yè)。液氮超低溫凍結(jié)法保藏時(shí)間長(zhǎng)；保藏效果好，菌種不易退化；對(duì)設(shè)備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對(duì)人員操作水平要求高；保藏成本高。當(dāng)前89頁(yè)，總共97頁(yè)。不同保藏方法的比較當(dāng)前90頁(yè)，總共97頁(yè)。六、質(zhì)控微生物當(dāng)前91頁(yè)，總共97頁(yè)。保藏菌株要求藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。922010版中國(guó)藥典《藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則》當(dāng)前92頁(yè)，總共97頁(yè)。國(guó)內(nèi)認(rèn)可的菌種收藏機(jī)構(gòu)1979年7月，全國(guó)第一屆菌種