分子標(biāo)記及應(yīng)用

分子標(biāo)記及應(yīng)用第一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容一、背景知識(shí)二、分子標(biāo)記及其應(yīng)用博誠(chéng)第二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日背景知識(shí)

遺傳—通過(guò)細(xì)胞染色體（DNA）由祖先向后代傳遞的品質(zhì)。

基因表達(dá)—指細(xì)胞在生命過(guò)程中，把儲(chǔ)存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。背景知識(shí)博誠(chéng)第三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

變異—指生物體子代與親代之間的差異，子代個(gè)體之間的差異的現(xiàn)象。變異分為可遺傳變異與不可遺傳變異。前者是由于環(huán)境變化而造成，不會(huì)遺傳給后代，如由于水肥不足而造成的植株瘦弱矮??；后一變異是由于遺傳物質(zhì)的改變所致。背景知識(shí)博誠(chéng)第四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

遺傳多樣性—種內(nèi)不同種群之間或同一種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和。遺傳多樣性可以表現(xiàn)在多個(gè)層次上，如分子、細(xì)胞、個(gè)體等。第五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日分子標(biāo)記？

所謂“標(biāo)記”，是指“便于識(shí)別的標(biāo)識(shí)或者記號(hào)”。分子標(biāo)記的本質(zhì)是便于識(shí)別的特異性DNA片段，能夠識(shí)別生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異，直接反映了DNA水平的遺傳多態(tài)性。分子標(biāo)記

在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析?，F(xiàn)在分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，應(yīng)用廣泛。

博誠(chéng)第六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日分子標(biāo)記主要技術(shù)1）RFLP:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性2）RAPD:隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA3）AFLP:擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性4）MLPA:多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)5）VNTR:數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性6）STR:簡(jiǎn)單重復(fù)序列或微衛(wèi)星標(biāo)記7）SNP:單核苷酸多態(tài)性8)SSCP:單鏈構(gòu)象多態(tài)性分子標(biāo)記博誠(chéng)第七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)是一種以DNA—DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標(biāo)記。用于分析相關(guān)基因多態(tài)性的技術(shù)。即用同一種限制性內(nèi)切酶，酶切來(lái)源于同一物種不同個(gè)體的基因組DNA，從而獲得長(zhǎng)度各異的DNA片段。1、限制性片段多態(tài)性分析—RFLP分子標(biāo)記博誠(chéng)第八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日分子標(biāo)記流程：酶切電泳標(biāo)記探針雜交轉(zhuǎn)移至膜分析顯色第九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日RFLP技術(shù)特點(diǎn)1、分析所需DNA量較大，2、步驟較多，周期長(zhǎng)，3、制備探針及檢測(cè)中要用到放射性同位素缺點(diǎn)2、是一種共顯性標(biāo)記，可區(qū)分純合體與雜合體。優(yōu)點(diǎn)1、結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。分子標(biāo)記博誠(chéng)第十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日1、遺傳多樣性的研究 2、構(gòu)建遺傳圖譜3、標(biāo)定基因4、分子水平上選擇目的性狀5、對(duì)作物數(shù)量性狀基因進(jìn)行定位6、進(jìn)行品種或品系遺傳純度的測(cè)定應(yīng)用品種鑒定作物遺傳育種這種技術(shù)可以用于遺傳指紋和親子鑒定

分子標(biāo)記博誠(chéng)第十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日2、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)—RAPD

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)以單一的隨機(jī)引物(一般為10個(gè)堿基)利用PCR技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增未知序列的基因組DNA獲得的DNA片段長(zhǎng)度變異。它是利用隨機(jī)引物通過(guò)PCR反應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。分子標(biāo)記博誠(chéng)第十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日RAPD標(biāo)記分子標(biāo)記博誠(chéng)PCR電泳顯色分析隨機(jī)引物試驗(yàn)步驟：第十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日RAPD的優(yōu)點(diǎn)：無(wú)種屬特異性適合于自動(dòng)化分析不需制備探針、雜交等程序，成本較低。DNA用量少，允許快速、簡(jiǎn)單地分離基因組DNA。RAPD缺點(diǎn)：是一種顯性標(biāo)記穩(wěn)定性較差分子標(biāo)記博誠(chéng)RAPD技術(shù)特點(diǎn)第十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日RAPD可用于對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜。1、品種鑒定、系譜分析：用于識(shí)別種群、家族、種內(nèi)或種間的遺傳變異，為生物血緣關(guān)系或分類提供依據(jù)，還可以分析混合基因組樣品等。2、基因定位：例如定位了萵苣霜霉病抗性基因。應(yīng)用平臺(tái)分子標(biāo)記博誠(chéng)第十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日3、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性—

AFLP

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增DNA時(shí)出現(xiàn)的片段長(zhǎng)度多態(tài)的現(xiàn)象。分子標(biāo)記博誠(chéng)第十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日博誠(chéng)注：引物1：人工接頭的互補(bǔ)鏈引物2：接頭互補(bǔ)鏈上添加1—3個(gè)選擇性核苷酸片段邊接

DNA限制性內(nèi)切酶隨機(jī)限制片段引物1PCR引物2PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳分析雙鏈人工接頭的酶切片段實(shí)驗(yàn)步驟第十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日優(yōu)

點(diǎn)AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、具有分辨率高2、穩(wěn)定性好3、效率高的優(yōu)點(diǎn)AFLP特點(diǎn)1、試驗(yàn)成本高2、對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高缺

點(diǎn)第二十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日AFLP廣泛用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因組研究、遺傳育種、親子鑒定、遺傳病診斷等領(lǐng)域。

AFLP產(chǎn)生的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)RFLP和RAPD等技術(shù)，因而被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)。但該技術(shù)已申請(qǐng)專利，在生產(chǎn)及商業(yè)上的應(yīng)用受到一定的限制。分子標(biāo)記博誠(chéng)AFLP應(yīng)用第二十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日AFLP在動(dòng)物品種鑒定中的應(yīng)用生物遺傳距離鑒定動(dòng)植物品種鑒定種間鑒定微生物鑒定細(xì)菌/病毒種屬鑒定分子標(biāo)記第二十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日4、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)—

MLPA

多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA）是一種針對(duì)待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的技術(shù)。該技術(shù)高效、特異，在一次反應(yīng)中可以檢測(cè)45個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，目前已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究。分子標(biāo)記博誠(chéng)第二十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日1、高效：一次反應(yīng)可以檢測(cè)45個(gè)靶序列拷貝數(shù)的改變。2、特異：可以檢測(cè)點(diǎn)突變。3、快速：一次實(shí)驗(yàn)可以在24小時(shí)內(nèi)完成。4、簡(jiǎn)便：不同的試劑盒操作基本相同，容易掌握。分子標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)1、需要精確測(cè)量DNA的濃度，樣本容易被污染。2、不能用于單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)。3、MLPA用于檢測(cè)基因的缺失或重復(fù)，不適合檢測(cè)未知的點(diǎn)突變類型。4、不能檢測(cè)染色體的平衡易位。局限性第二十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日MLPA的應(yīng)用1、檢測(cè)染色體亞端粒的基因重排—基因診斷和產(chǎn)前診斷2、檢測(cè)染色體的非整倍性改變——染色體非整倍遺傳病檢測(cè)產(chǎn)前診斷3、檢測(cè)單核苷酸的多態(tài)性（SNP）和點(diǎn)突變分子標(biāo)記博誠(chéng)

目前已被廣泛應(yīng)用于基因片段缺失與重復(fù)、點(diǎn)突變及甲基化檢測(cè)等相關(guān)疾病的分子生物學(xué)研究。第二十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第二十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第二十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日5、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性—VNTR

可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)

又稱小衛(wèi)星(MinisatelliteDNA)，是一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10一10001不等。分子標(biāo)記博誠(chéng)VNTR基本原理與RFLP大致相同。第二十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日分子標(biāo)記1、數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻2、實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、合成探針困難、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)3、成本高缺點(diǎn)1、種類多，多態(tài)信息含量較高2、分布廣優(yōu)點(diǎn)VNTR技術(shù)特點(diǎn)第二十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日VNTR應(yīng)用VNTR是一種好的分型方法，并可用于流行病學(xué)追蹤和菌株親緣關(guān)系確定（1）、結(jié)核分枝桿菌基因分型研究（2）、以VNIR為基礎(chǔ)的麻風(fēng)病地理分型（3）、布氏桿菌分子亞型分析（4）、鉤端螺旋體MLVA基因分型方（5）、廣東人vWF基因40內(nèi)含子VNTR檢測(cè)及其在親緣鑒定中的應(yīng)用第三十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

應(yīng)用VNTR技術(shù)結(jié)核分枝桿菌基因分型第三十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日Geneticfingerprinting分子標(biāo)記第三十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第三十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日分子標(biāo)記Parentsandoffspringhavesimilargeneticfingerprints博誠(chéng)親子鑒定第三十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

短串聯(lián)重復(fù)序列(simpletandemrepeats,STR)又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeats,SSR），也稱微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite），是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列。其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1-6bp，最常見(jiàn)是雙核苷酸重復(fù)，即(CA)n和(TG)n。微衛(wèi)星DNA的高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間,呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛。6、短串聯(lián)重復(fù)序列—STR分子標(biāo)記博誠(chéng)第三十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日STR技術(shù)主要應(yīng)用在植物育種中，如構(gòu)建遺傳圖譜、DNA指紋圖譜的建立、種質(zhì)資源的遺傳多樣性等。STR分析的主要應(yīng)用分子標(biāo)記博誠(chéng)第三十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日STR標(biāo)記分子標(biāo)記博誠(chéng)第三十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日分子標(biāo)記STR檢測(cè)雜交種鄭單958純度P1:父本；P2：母本；1-22：雜交種MP1P2博誠(chéng)第三十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日7、核苷酸多態(tài)性—SNP

核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism)是基于DNA芯片技術(shù)的第三代DNA遺傳標(biāo)記技術(shù)。

SNP是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間僅有個(gè)別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)，SNP標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異。人類基因組大約每1250bpSNP出現(xiàn)一次，已有2000多個(gè)標(biāo)記定位于人類染色體，對(duì)人類基因組學(xué)研究具有重要意義。分子標(biāo)記博誠(chéng)第三十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日分子標(biāo)記博誠(chéng)第四十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)高密度、高遺傳穩(wěn)定性、易于分析第四十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日SNP應(yīng)用領(lǐng)域遺傳疾病研究基因連鎖和關(guān)聯(lián)分析藥物基因組學(xué)藥物發(fā)現(xiàn)/藥靶農(nóng)業(yè)/畜牧業(yè)遺傳學(xué)法醫(yī)/個(gè)體識(shí)別其它分子標(biāo)記博誠(chéng)第四十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日8、SSCP

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)是一種簡(jiǎn)便的點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)，可以分離相同長(zhǎng)度但序列不同的核酸。這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性形成單鏈后，相同長(zhǎng)度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，不同的構(gòu)象電泳遷移速度出現(xiàn)差異并形成