基因工程3載體中國藥科大學(xué)生物工程所有課件_第1頁
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基因工程3載體中國藥科大學(xué)生物工程所有課件第1頁/共71頁相關(guān)概念有用基因亦稱為目的基因或插入物用于接受重組DNA的擴(kuò)增載體及其插入物或表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞謂之宿主插入物的擴(kuò)增過程稱為分子克隆攜帶重組DNA分子的宿主為基因工程細(xì)胞(菌)或重組細(xì)胞(菌)第2頁/共71頁基因工程載體的必備條件1、具有有效運(yùn)載能力2、攜帶外源性目的基因前后在宿主內(nèi)功能自主復(fù)制3、在宿主內(nèi)能控制外源基因表達(dá)活動(dòng)4、鑒定方便,裝卸手續(xù)簡(jiǎn)單5、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小,

載力要大6、容易控制、安全可靠、穩(wěn)定性好第3頁/共71頁三大類基因工程載體

細(xì)菌質(zhì)粒病毒DNA基因真核表達(dá)植物表達(dá)(煙草花葉病毒)動(dòng)物表達(dá)(腺病毒)噬菌體DNA第4頁/共71頁一、細(xì)菌質(zhì)粒

㈠、質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)

細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)。絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復(fù)制子。(現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有線性質(zhì)粒,酵母的殺傷質(zhì)粒是一種RNA質(zhì)粒)第5頁/共71頁環(huán)形雙鏈質(zhì)粒分子具有三種不同構(gòu)型1、共價(jià)閉合環(huán)形DNA(SCDNA):兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu);2、開環(huán)DNA(OCDNA):兩條鏈中只有一條保持完整環(huán)形結(jié)構(gòu),另一條鏈出現(xiàn)一至數(shù)個(gè)缺口;3、線性分子DNA(LDNA)通稱L構(gòu)型:質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶切割后,發(fā)生雙鏈斷裂而形成;

以上三種不同的構(gòu)型的同一種質(zhì)粒,盡管分子量相同,但在瓊脂糖凝膠電泳中,電泳遷移率不同,順序是SCDNA、LDNA、OCDNA第6頁/共71頁質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)①分子量小,差異顯著,小的分子量為106dal,大的可達(dá)108dal。②易于在宿主間轉(zhuǎn)移和遷移。③在宿主內(nèi)可伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制,與宿主呈共生關(guān)系。④且其存在與否與宿主生死無關(guān)。⑤編碼宿主染色體不具有的基因,賦予宿主細(xì)胞額外遺傳特性(如抗生素抗性)第7頁/共71頁㈡、質(zhì)粒的分類迄今為止,人們已在大腸桿菌的各種菌株中找到了許多種不同類型的質(zhì)粒,其中已經(jīng)作了較詳盡研究,了解比較透徹的主要有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。由于這些質(zhì)粒的存在,寄主細(xì)胞便獲得了各自不同的性狀特征,我們可以依據(jù)這些特征來鑒別這三種不同類型的質(zhì)粒。第8頁/共71頁1、F質(zhì)粒

又叫F因子(fertilityfactor)或性質(zhì)粒(sexplasmid),

這是由于它能夠使寄主染色體上的基因和F質(zhì)粒一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體胞中去而得名。是在某些大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種具有代表性的單拷貝的接合型質(zhì)粒,其大小約為94kb左右,總共編碼

19個(gè)轉(zhuǎn)移基因(tra)。第9頁/共71頁在寄主中,F(xiàn)質(zhì)粒有三種不同的存在方式1、以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在,其上不帶有任何來自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段。這樣的細(xì)胞叫F+細(xì)胞2、以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在,同時(shí)在其上還攜帶著細(xì)菌的染色體基因或DNA區(qū)段。這樣的細(xì)胞叫F’細(xì)胞3、以線性DNA形式從不同位點(diǎn)整合到寄主染色體上,這樣的細(xì)胞叫做Hfr(Highfrequentialrecomhimant)

高頻重組細(xì)胞第10頁/共71頁2、R質(zhì)粒通稱抗藥性因子。在其結(jié)構(gòu)中編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因,并且通常能夠?qū)⒋朔N抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞,使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。第11頁/共71頁第12頁/共71頁3、Col質(zhì)粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌素是一類可以使不帶有Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死的蛋白質(zhì)。第13頁/共71頁革蘭氏陰性菌的質(zhì)??煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞(接合作用),如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R的其他成員第14頁/共71頁F因子屬接合型質(zhì)粒,而Col質(zhì)粒和R質(zhì)粒中,既有屬于接合型的,也有屬于非接合型的。從基因工程的角度考慮,感興趣的主要是非接合型質(zhì)粒,這是因?yàn)榻雍闲偷馁|(zhì)粒不僅能夠自我從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞,而是還能夠轉(zhuǎn)移染色體記號(hào)。因此,如果使用接合型質(zhì)粒作載體,在理論上存在著發(fā)生使DNA跨越生物種間遺傳屏障的潛在危險(xiǎn)性。第15頁/共71頁㈢、重要的質(zhì)粒載體目前常用于基因克隆的質(zhì)粒載體均為人工構(gòu)建。經(jīng)改造后達(dá)到這些要求:①其分子結(jié)構(gòu)中必須具有多個(gè)單一限制酶切割位點(diǎn),且切點(diǎn)最好位于選擇性標(biāo)記上②構(gòu)建重組質(zhì)粒后必須具有轉(zhuǎn)化功能③最好帶有兩個(gè)以上強(qiáng)選擇性標(biāo)記④分子量較小,為松弛型復(fù)制控制,易于操作⑤宿主范圍小,無感染性,不受其他質(zhì)粒誘動(dòng)。第16頁/共71頁1、ColE1質(zhì)粒載體

ColE1質(zhì)粒屬大腸桿菌Col類質(zhì)粒中的一種,由于攜帶Col質(zhì)粒的許多細(xì)菌都能產(chǎn)生一類叫做細(xì)菌素的物質(zhì),故Col質(zhì)粒又被稱作細(xì)菌素質(zhì)粒。細(xì)菌素是一類特殊蛋白質(zhì),它通過同敏感細(xì)胞細(xì)胞壁的融合作用,而抑制一種或數(shù)種在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的生命過程,如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及能量代謝等,從而使這些細(xì)胞停止生長(zhǎng)。第17頁/共71頁第18頁/共71頁總結(jié):①分子量4.2×106dal,攜帶Col質(zhì)粒的許多菌能產(chǎn)生細(xì)菌素②ColE1編碼大腸桿菌素E1基因和大腸桿菌素E1

免疫基因。有單一EcoRⅠ切點(diǎn),切開接入外源基因后,雖失去大腸桿菌素E1能力,但卻不影響DNA復(fù)制能力③屬松弛型復(fù)制,多拷貝,拷貝數(shù)可大1000-3000第19頁/共71頁2、pSC101質(zhì)粒載體

pSC101是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體,平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1-2個(gè)拷貝。其分子大小為9.09kb,編碼一個(gè)四環(huán)素抗性基因(tetr),

該質(zhì)粒對(duì)EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、

PvuⅡ和SmaⅠ等7種限制酶有單一識(shí)別位點(diǎn)。其中HindⅢ、BamHⅠ和SalⅠ等3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA

都會(huì)使tetr失活。(插入失活效應(yīng))第20頁/共71頁pSC101質(zhì)粒載體性質(zhì):①嚴(yán)緊型復(fù)制控制低拷貝1-2個(gè)拷貝/細(xì)胞②9.09kb③編碼一個(gè)tetr,有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ等7個(gè)酶切單一位點(diǎn),可插入失活。缺點(diǎn):低拷貝,表達(dá)效率低。pSC101是第一個(gè)成為用于克隆真核DNA的大腸桿菌質(zhì)粒載體,1973年成功地將帶有非洲爪蟾核糖體基因的EcoRIDNA片段,連接到pSC101復(fù)制子上。第21頁/共71頁應(yīng)用pSC101質(zhì)粒載體在大腸桿菌細(xì)胞中克隆非洲爪蟾的基因第22頁/共71頁3、pBR322

是一種人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒

特點(diǎn):①帶有多種抗藥性的強(qiáng)選擇記號(hào)②具有低分子量,高拷貝③外源DNA插入不影響復(fù)制功能④有多種核酸內(nèi)切限制酶單切割位點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):①自身分子量小4363bp②同時(shí)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)③具有較高的拷貝數(shù)命名:p:表示質(zhì)粒

BR:分別取自兩位主要構(gòu)建者F.Bolioax

和R.L.Rodrignez姓氏的頭一個(gè)字母

322:指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)第23頁/共71頁普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖第24頁/共71頁第25頁/共71頁pBR322由三個(gè)不同的部分組成1、來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的ampr2、來源于pSC101質(zhì)粒的tetr3、來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)第26頁/共71頁4、pUC質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒是在pBR322載體質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,組入了一個(gè)在其5‘端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因,而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。pUC取名是根據(jù)它們的加州大學(xué)(UniversityofCalifornia)的科學(xué)家J.Messing和J.Vieria于1987年首先構(gòu)建的第27頁/共71頁(1)pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)pUC系列質(zhì)粒載體包括以下四個(gè)組成部分:①來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)ori);②氨芐青霉素抗性基因Ampr,但它的DNA中核苷酸序列已發(fā)生了變化,不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別位點(diǎn);③大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列,此結(jié)構(gòu)稱為lacZ`基因;④位于lacZ’基因中的靠近5`端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段,但它并不破壞該基因的功能。第28頁/共71頁pUC18/19:正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal5-溴-4-氯靛藍(lán)(藍(lán)色)第29頁/共71頁476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列,表達(dá)半乳糖苷酶的α片段。LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子Plac和操縱基因O。lacZ之內(nèi)有M13的多功能連接器——多克隆位點(diǎn)(MCS)。第30頁/共71頁(2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)①具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷貝數(shù)(500~700)②適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體③具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段,可以更方便的插入外源基因第31頁/共71頁二、噬菌體載體和柯斯載體(cosmid)

及單鏈DNA噬菌體載體(M13)(一)λ噬菌體DNA1、λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)λ噬菌體為雙鏈DNA病毒,宿主為E.Coli。在宿主內(nèi)有溶菌和溶源兩種形式,在溶源方式中,噬菌體感染宿主后其DNA整合到宿主染色體DNA中,伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。第32頁/共71頁第33頁/共71頁λ噬菌體DNA是有48502bp組成的線性雙螺旋分子,分子量3.1×107dal。迄今已定位的基因至少61個(gè),其中一半?yún)⑴c了噬菌體生命周期的活動(dòng),我們稱這類基因?yàn)棣耸删w的“必要基因”;另一部分基因,當(dāng)它們被外源基因取代后,并不影響噬菌體的生命功能,我們稱這類基因?yàn)棣耸删w的“非必要基因”。這為其作為基因工程噬菌體載體的基礎(chǔ)。野生型的λ噬菌體DNA兩端各具12個(gè)核苷酸組成的粘性末端,可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒(cosmid)。第34頁/共71頁l噬菌體生物學(xué)特性:生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’

COSCOScos頭部合成基因

尾部合成基因

溶菌控制基因

晚期控制基因DNA合成控制基因

阻遏基因

早期控制基因

阻遏基因

重組基因

刪除與整合基因l-DNA第35頁/共71頁2、

λ噬菌體DNA克隆載體野生型的λDNA不適宜作為克隆載體。因?yàn)棰牌浞肿恿枯^大,⑵常用的限制酶切點(diǎn)較多。如EcoRI切點(diǎn)5個(gè),HindⅢ切點(diǎn)7個(gè),而這些切點(diǎn)大多位于溶菌周期生長(zhǎng)所必須基因內(nèi),容納不下比其更大的外源性DNA片段,必須對(duì)其進(jìn)行改造。第36頁/共71頁改造方法:①將噬菌體感染到具有EcoRI限制修飾體系的和不具有EcoRI限制修飾體系的兩種寄主細(xì)胞中循環(huán)生長(zhǎng),使λDNA的EcoRI位點(diǎn)發(fā)生修飾作用或產(chǎn)生點(diǎn)突變,使其一些EcoRI位點(diǎn)不能再被EcoRI切割。最終篩選獲得僅有1-2個(gè)限制酶位點(diǎn)的λDNA。②將λDNA在體外用限制酶消化,再將未切割部分包裝并感染E.Coli。如野生型λDNA上有7個(gè)HindⅢ限制位點(diǎn),從圖中可看出,E.Coli位點(diǎn)1和2之間片段的缺失,可降解去兩個(gè)HindⅢ位點(diǎn)1和2。第37頁/共71頁按此上方法,可構(gòu)建兩類λ噬菌體派生載體①取代型載體或替換型載體(replacementvector)它具有成對(duì)的克隆位點(diǎn),這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。如λEMBL4和Charon40。(圖5-12)第38頁/共71頁②插入型載體(insertionvectors)只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)(也有一些具有兩個(gè)插入位點(diǎn))。外源性DNA克隆到插入型的λ載體分子上會(huì)使噬菌體的某中生物功能喪失,即所謂插入失活效應(yīng)。如免疫功能失活的和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。第39頁/共71頁

許多Charon載體帶有編碼β-半乳糖苷酶基因以及它的操控基因和啟動(dòng)子的lac5取代區(qū)段,如Charon4噬菌體可以在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出深藍(lán)色的噬菌斑。而當(dāng)含有l(wèi)ac5的EcoRI片段被外源DNA取代后,所形成的重組噬菌體就只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑,可以很方便的進(jìn)行重組體篩選。(圖5-13)凱倫噬菌體載體(Charonbacteriophage)我們把這些經(jīng)過改造的噬菌體載體稱為:

是F.R.Blattner等人于1977年在λ噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種特殊的噬菌體載體。這類載體有插入型的如Charon2,亦有替換型的如Charon30。他們?cè)诨蚬こ虒?shí)驗(yàn)中用途十分廣泛。第40頁/共71頁第41頁/共71頁載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本操作:AprlacZ'oriAp+X-gal重組子(Apr+lacZ-)

將外源基因克隆在Charon噬菌體載體的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部,使之滅活,此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-,清亮噬菌斑;而非重組子則呈Apr、lacZ+,藍(lán)色噬菌斑第42頁/共71頁3、λDNA載體重組分子的體外包裝

以λ噬菌體DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感染宿主的能力。λ噬菌體的正常包裝過程1、先按滾環(huán)復(fù)制合成多連體的DNA,2、這些DNA在具備噬菌體頭部前體和A基因產(chǎn)物的條件下,從cos位點(diǎn)處被切割成λDNA單體分子,并被很快裝填到頭部外殼里邊,3、它具有的12bp長(zhǎng)的粘性末端,又會(huì)重新環(huán)化起來,4、基因產(chǎn)物便滲入到完整的頭部,接著通過基因W和基因FII產(chǎn)物的作用,把頭部與尾部結(jié)構(gòu)連成一體,最終形成成熟的λ噬菌體顆粒。第43頁/共71頁第44頁/共71頁體外包裝過程利用兩個(gè)琥珀突變種噬菌體,一個(gè)是Damλ噬菌體,產(chǎn)生頭部蛋白。另一個(gè)是λ噬菌體Eam突變體產(chǎn)生尾部蛋白。上述溶菌物與重組DNA混合后,基因E產(chǎn)物(主要為外殼蛋白)在基因A產(chǎn)物作用下,與基因D產(chǎn)物一起將重組DNA包裝成噬菌體頭部,在基因W及基因F產(chǎn)物作用下,將頭部和尾部連接成完整噬菌體顆粒。第45頁/共71頁特點(diǎn):經(jīng)包裝后重組DNA分子轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。這類載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。第46頁/共71頁(二)科斯質(zhì)粒載體(Cosmidvectors)1、概述λ噬菌體一般有效克隆外源基因范圍僅為15kb左右,但有些基因可達(dá)35-40kb,甚至更大,同時(shí)λ噬菌體不能夠同時(shí)克隆兩個(gè)連鎖基因。為此,1978年,J.Clooins及B.Hohn等人發(fā)展出科斯質(zhì)粒載體,可滿足以上需要?!癱osmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成,其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)(cos)的質(zhì)粒。定義:科斯質(zhì)粒是人工構(gòu)建的,含有λDNA的粘性(cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個(gè)抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與λ噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的特殊載體。(圖5-18)第47頁/共71頁第48頁/共71頁2、Cosmid的特點(diǎn)目前已有許多不同類型的科斯質(zhì)粒載體,其特點(diǎn)如下:①具有λ噬菌體的特性;②具有質(zhì)粒載體特性;③具有高容量的克隆能力;④具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。第49頁/共71頁3、科斯克隆應(yīng)用科斯質(zhì)粒載體,在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù),叫做科斯克隆(cosmidcloning)。第50頁/共71頁先用特定的核酸內(nèi)切酶局部切割真核生物DNA,產(chǎn)生較高分子量的外源DNA片段,與經(jīng)同樣酶切割過的科斯質(zhì)粒線性分子進(jìn)行體外連接反應(yīng),由此形成的連接產(chǎn)物群體中,有一定比例的分子是兩端各有一個(gè)cos位點(diǎn)的長(zhǎng)度為40kb左右的真核DNA片段,而且這兩個(gè)cos為點(diǎn)在取向上是一致的,它可作為Ter體系的一種通用底物。當(dāng)加入λ噬菌體的包裝連接物時(shí),它將能識(shí)別并切割這種兩端由cos位點(diǎn)包圍著的35-45kb長(zhǎng)的真核DNA片段,并把這些分子包裝進(jìn)入噬菌體的頭部。(圖5-19)第51頁/共71頁第52頁/共71頁(三)單鏈DNA噬菌體M13載體1、概述噬菌體M13宿主為絲狀E.Coli,其遺傳物質(zhì)為單鏈環(huán)狀DNA,故稱為單鏈DNA噬菌體。其DNA分子長(zhǎng)度為6500bp。M13是一種雄性大腸桿菌特有的噬菌體,因此它們只能感染帶有F性須的大腸桿菌菌株。其復(fù)制過程如下:第53頁/共71頁M13噬菌體的生物學(xué)特性:感染周期+DNA(+)DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV第54頁/共71頁第55頁/共71頁第56頁/共71頁2、M13克隆體系中β半乳糖苷酶顯色反應(yīng)M13克隆體系,包括M13噬菌體本身和寄主菌株兩個(gè)組成部分。但無論M13載體,還是大腸桿菌寄主菌株(如JM101),單獨(dú)都不能產(chǎn)生有功能活性的β半乳糖苷酶,而這種酶的活性可以用X-gal顯色法測(cè)定出來。第57頁/共71頁

在M13體系中,已將Lac阻遏基因的Iq突變引入宿主細(xì)胞。該Iq突變基因可產(chǎn)生出10余倍超量的阻遏物。這些阻遏物的存在可以抑制Lac操縱子的表達(dá)。IPTG是一種乳糖類似物,再無乳糖的條件下,他可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成半乳糖苷酶。因此,IPTG被稱為β半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物。安慰誘導(dǎo)劑第58頁/共71頁3、M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)①單鏈DNA噬菌體的復(fù)制是以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介的,這種RFDNA可以如同質(zhì)粒DNA一樣,在體外進(jìn)行純化和操作。②不論是RFDNA還是ssDNA,它們都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的E.Coli寄主細(xì)胞產(chǎn)生出噬菌斑③單鏈DNA噬菌體顆粒的大小,是受其DNA多寡的制約,因此,并不存在包裝限制。

第59頁/共71頁④應(yīng)用這類單鏈DNA噬菌體,可以容易地控制外源DNA片段的插入取向。⑤可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA片段插入的單鏈

DNA分子。這種單鏈DNA分子可按雙脫氧鏈終止法做核苷酸序列測(cè)定,也可用于制備具放射性同位素標(biāo)記的DNA探針,可以進(jìn)行寡核苷酸定點(diǎn)突變??傊琈13載體兼具質(zhì)粒載體與λ噬菌體的優(yōu)點(diǎn)。第60頁/共71頁采用Sanger雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法:測(cè)序三要素:1、模板——DNA母鏈。新合成鏈按堿基互補(bǔ)原則(A-T,C-G)進(jìn)行。2、引物——DNA短鏈。起起始合成作用。3、酶、底物(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)和非正常底物(ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP)。

DNA序列測(cè)定法第61頁/共71頁第62頁/共71頁第63頁/共71頁三、真核基因病毒載體病毒載體優(yōu)點(diǎn)是:1、有很高的拷貝數(shù);2、強(qiáng)大的啟動(dòng)子,可保證外源基因的高效表達(dá);3、可保證糖基化。常用的有SV40病毒載體及昆蟲桿狀病毒載體。第64頁/共71頁真核基因表達(dá)載體應(yīng)具備的條件:1、含有原核基因的復(fù)制起始序列(如ColEI起始序列ori)以及篩選標(biāo)記(如使E.Coli具有Ampr的β-內(nèi)酰胺酶基因)。這樣便于在E.Coli細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和篩選

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