高滴度的生長分化因子-15多克隆抗體制備,基因工程論文

高滴度的生長分化因子-15多克隆抗體制備,基因工程論文生長分化因子〔growthdifferentiationfactor-15,GDF-15〕又名MIC-1、PDF、PLAB、PTGFB或NAG-1,是轉(zhuǎn)化生長因子〔TGF-〕超家族成員[1].GDF-15是一種分泌型二聚體蛋白，其基因位于19號染色體的p12.1-13.1,翻譯后的前體蛋白由308個氨基酸殘基組成，經(jīng)剪切生成2條含112個氨基酸殘基的多肽鏈，再通過分子間二硫鍵構(gòu)成同源二聚體的成熟形式后，分泌到胞外發(fā)揮功能[2].GDF-15高表示出于胎盤和成人的前列腺組織中，而在其他組織中低表示出。在病理和應(yīng)激環(huán)境下，GDF-15的表示出量明顯升高。多項研究表示清楚，GDF-15不但介入免疫反響[4-5],與多種心臟疾病的診斷、預(yù)后存在相關(guān)性[3],而且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,7].大量文獻(xiàn)表示清楚GDF-15在很多腫瘤組織中高表示出，能夠作為結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌的血清早期診斷標(biāo)志物[8].與其他TGF-超家族成員類似，GDF-15能夠通過活化細(xì)胞外表TGF-Ⅰ型和Ⅱ型受體，進(jìn)而募集并激活下游Smad信號通路來發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)功能，可能在腫瘤發(fā)生的早期階段發(fā)揮抑瘤作用，而在晚期階段轉(zhuǎn)而促瘤[9-10].本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，GDF-15與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)[6],是潛在的腫瘤治療靶標(biāo)，我們擬采用抗體特異性阻斷的方式方法在動物水平檢驗其靶向治療的可行性。但市售的GDF-15抗體種類少、價格高，難以知足實驗需求。因而，在本研究中，我們通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組融合蛋白GDF-15的原核表示出系統(tǒng)，獲得純度較高的抗原蛋白，在這里基礎(chǔ)上制備了高滴度的GDF-15多克隆抗體，為后續(xù)靶向治療研究的開展奠定基礎(chǔ)。1材料與方式方法1.1材料BALB/c小鼠來自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心；HT29、sw480、caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞購自ATCC;大腸桿菌BL21、DH5，pET-32a〔+〕載體由本實驗室提供。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；抗GDF-15抗體購自Abnova公司；兔抗人-actin一抗、HRP標(biāo)記的二抗購自中杉金橋公司；其他試劑均為分析純產(chǎn)品。據(jù)已報道的人GDF-15基因編碼區(qū)序列設(shè)計上游引物〔5-CGGGATCCATGGCGCGTGCGCG-3〕和下游引物〔5-CCCTCGAGCTATATGCAGTGGCAGTCTTTGG-3〕，由上海生工公司合成。1.2重組質(zhì)粒pET-32a〔+〕-GDF-15的構(gòu)建提取人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,設(shè)計GDF-15特征性引物，體外擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收克隆片段，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接到經(jīng)同樣雙酶切的pET-32a〔+〕載體上，將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中，接種到含氨芐西林的LB瓊脂糖培養(yǎng)板中，37℃孵箱中培養(yǎng)12h,挑選出陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定，將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pET32a〔+〕-GDF-15.1.3重組GDF-15的誘導(dǎo)表示出和純化將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，挑選單克隆，將含pET-32a〔+〕-GDF-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，參加終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)6h后收集菌體，參加5倍SDS上樣緩沖液，混勻煮沸10min,12000r/min離心5min,SDS鑒定GDF-15的表示出。經(jīng)SDS鑒定挑選出GDF-15高表示出的菌落，誘導(dǎo)表示出，離心收集菌體，將菌體重懸于細(xì)菌裂解緩沖液中，冰上超聲波裂解〔功率300W,超聲5s,間歇10s〕，離心20min,棄上清，用8mol/L尿素溶解包容體。離心后取上清進(jìn)行Ni親和層析純化，以10倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌3次，洗脫緩沖液洗脫重組蛋白并收集，SDS檢測純化后的GDF-15蛋白。1.4GDF-15蛋白的復(fù)性與鑒定對變性的蛋白進(jìn)行復(fù)性，分別用8、6、4、2mol/L尿素和不含尿素的PBS溶液對GDF-15蛋白進(jìn)行透析，每次6h;對復(fù)性后的蛋白經(jīng)SDS鑒定相對分子質(zhì)量；SDS后，用300mA電流轉(zhuǎn)膜1h,室溫封閉2h,用1∶3000稀釋的GDF-15一抗于4℃孵育過夜，用1∶5000稀釋的二抗于室溫孵育1h,Western印跡鑒定能否為GDF-15蛋白。1.5GDF-15多克隆抗體的制備將純化的蛋白用PBS稀釋并與等量完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫6~8周齡雄性BALB/c小鼠〔80g/每只〕；2周后，將蛋白與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化后加強(qiáng)免疫；每2周加強(qiáng)免疫一次，末次免疫14d后取血，分離血清，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?.6GDF-15多克隆抗體效價檢測采用間接ELISA檢測抗體滴度。用100ng/200LGDF-15包被酶標(biāo)板，4℃過夜后棄掉液體，參加5mg/LBSA封閉緩沖液〔0.1mol/LNaHCO3,pH8.6〕于37℃封閉2h;傾去液體，用TBST〔1mL/LTween-20,TBS〕洗5次，每次2min;每孔參加HRP標(biāo)記的小鼠二抗抗體〔1∶5000〕100L,37℃孵育1h;用TBST洗3次，參加OPD顯色液，37℃顯色15min;參加2mol/L硫酸終止反響，用酶標(biāo)儀測定D490nm值，P/N大于2.1為陽性，設(shè)立陰性對照為無關(guān)蛋白包板。1.7GDF-15多克隆抗體特異性鑒定取人結(jié)腸癌細(xì)胞sw480、caco-2,參加強(qiáng)效裂解液，冰上裂解1h,4℃、12000r/min離心20min,BCA法定量蛋白濃度，參加5倍上樣緩沖液煮沸10min,經(jīng)常規(guī)SDS后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%BSA室溫封閉1h,參加1∶500稀釋的抗血清，4℃孵育過夜，洗滌后用1∶5000稀釋的辣根酶標(biāo)記的抗鼠二抗室溫孵育1h,洗滌后ECL顯色，壓片，保存結(jié)果。2結(jié)果2.1GDF-15cDNA片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的制備用特異的上下游引物從結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的cDNA中擴(kuò)增出GDF-15基因，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1,擴(kuò)增片段約350bp.將目的基因插入pET-32a〔+〕載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-32a〔+〕-GDF-15,也在約350bp處可見GDF-15特異性條帶〔圖2〕，與預(yù)期結(jié)果一致。將獲得的pET-32a〔+〕-GDF-15質(zhì)粒測序，結(jié)果正確，講明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2GDF-15蛋白的誘導(dǎo)表示出及純化將轉(zhuǎn)化pET-32a〔+〕-GDF-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21培養(yǎng)后用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h,用全菌進(jìn)行SDS,結(jié)果見圖3,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在Mr約28103處出現(xiàn)明顯的表示出產(chǎn)物條帶。超聲波裂菌后，上清液經(jīng)Ni親和層析柱純化，250mmol/L咪唑洗脫獲得目的蛋白峰〔圖4〕，PBS透析后行SDS,顯示蛋白條帶位置正確、純度較好〔圖5〕。2.3GDF-15蛋白的鑒定將純化的蛋白行Western印跡檢測，結(jié)果顯示原核表示出的GDF-15融合蛋白能夠被特異性抗體辨別，抗原性良好〔圖6〕。2.4GDF-15多克隆抗體的制備和效價檢測將純化的GDF-15蛋白混合弗氏佐劑，皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠，進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫和3次加強(qiáng)免疫，末次免疫后14d取血，分離血清，ELISA檢測抗血清效價達(dá)1∶100000〔圖7〕。2.5GDF-15多克隆抗體檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性GDF-15的表示出以人結(jié)腸癌細(xì)胞系sw480、caco-2為檢測對象，采用本實驗制備的GDF-15抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，抗體能夠檢測到胞內(nèi)GDF-15,產(chǎn)生特異性條帶〔圖8〕，講明GDF-15抗體制備成功，可應(yīng)用于后續(xù)研究工作中。3討論GDF-15在調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反響、炎癥反響及成體急性損傷修復(fù)經(jīng)過中發(fā)揮著重要作用[11],而在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的功能研究尤為人們關(guān)注。針對前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌的研究顯示，GDF-15在血清中的含量與腫瘤組織惡性程度、細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力都存在明顯的相關(guān)性。還有文獻(xiàn)報道，GDF-15能夠介導(dǎo)腫瘤誘發(fā)的消瘦和厭食癥。不僅講明循環(huán)系統(tǒng)中的GDF-15水平能夠作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志，而且這些表示出于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的GDF-15也是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。為了用抗體封閉GDF-15,以研究其在腫瘤中的功能及其靶向藥物的應(yīng)用前景，我們首先要獲得大量的抗原蛋白。當(dāng)前市售的GDF-15多為CHO細(xì)胞表示出，成本高，生產(chǎn)周期長。因而，我們將人GDF-15序列克隆至原核表示出載體pET-32a〔+〕中，構(gòu)建了重組表示出質(zhì)粒，并建立了經(jīng)濟(jì)、高效的GDF-15原核表示出系統(tǒng)。在這里基礎(chǔ)上，我們用傳統(tǒng)方式方法制備了高滴度的GDF-15多克隆抗體，通過Western印跡檢測了結(jié)腸癌細(xì)胞sw480、caco-2中GDF-15的表示出，表示清楚我們制備的抗體能有效辨別人源GDF-15分子。以上結(jié)果為我們后續(xù)研究GDF-15靶向治療及其生物學(xué)功能和信號傳導(dǎo)通路奠定了基礎(chǔ)。以下為參考文獻(xiàn)[1]ConstamDB,RobertsonEJ.Regulationofbonemorphogeneticproteinactivitybyprodomainsandproproteinconvertases[J].JCellBiol,1999,144〔1〕：139-149.[2]UnsickerK,SpittauB,KrieglsteinK.ThemultiplefacetsoftheTGF-familycytoki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