表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范（編制說(shuō)明）

國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范規(guī)程制修訂《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》編制說(shuō)明上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院1《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》編制說(shuō)明一、任務(wù)來(lái)源根據(jù)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家計(jì)量技術(shù)法規(guī)制修訂文件(見市監(jiān)計(jì)量發(fā)[2021]50號(hào))，上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院、中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、中國(guó)計(jì)量測(cè)試學(xué)會(huì)、上海市食品藥品檢驗(yàn)所、南京市計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)院、北京英柏生物科技有限公司共同承擔(dān)《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》的制定工作，歸口單位為全國(guó)生物計(jì)量技術(shù)委員會(huì)。二、規(guī)范制定的必要性生物體內(nèi)分子間的相互作用是維持生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，研究人員對(duì)分子間相互作用的正確分析是了解生命活動(dòng)的關(guān)鍵因素。在抗體藥物篩選過(guò)程中，解離速率決定了抗體的在靶時(shí)間，解離速率慢的抗體成藥性更好，檢測(cè)解離速率的快慢完成排序，抓取出想要的候選分子；在抗體體外生物活性檢測(cè)項(xiàng)目中，親和力能夠作為藥物功效及半衰期的預(yù)測(cè)指標(biāo)；疫苗研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)對(duì)工藝流程中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(特別是生物活性)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，這些都需要進(jìn)行生物分子相互作用研究。生物分子相互作用分析儀可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的分子間結(jié)合、結(jié)合的快慢、結(jié)合的強(qiáng)弱以及結(jié)合的機(jī)理等所有分子間相互作用的高靈敏度檢測(cè)和分析，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)，癌癥研究，酶反應(yīng)，分子識(shí)別，免疫調(diào)節(jié)，生物材料，食品安全，環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域，尤其是在疫苗開發(fā)過(guò)程中有重要的作用。生物分子相互作用分析儀主要依托表面等離子共振技術(shù)(SPR)、等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)、石英晶體微天平技術(shù)(QCM)、微量熱泳動(dòng)技術(shù)(MST)和生物膜干涉技術(shù)(BLI)技術(shù)等。基于表面等離子共振SPR)技術(shù)的生物分子相互作用分析儀通過(guò)測(cè)量SPR角的改變，進(jìn)而獲得物質(zhì)量的變化信息，從而計(jì)算出該物質(zhì)的結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd以及親和力，由于無(wú)需任何標(biāo)記，能夠直接觀測(cè)原位、微量、靈敏、快速、動(dòng)態(tài)和實(shí)時(shí)的定量表征結(jié)合的全過(guò)程，成為最為經(jīng)典的生物分子相互作用分析儀，在市場(chǎng)上占有率極高。而且，基于SPR的生物分子相互作用檢測(cè)技術(shù)被中國(guó)、美國(guó)和日本藥典收錄，也被FDA免2疫原性指導(dǎo)原則推薦為抗體篩選方法。目前，基于SPR的生物分子相互作用分析儀在抗體藥研發(fā)過(guò)程中抗體篩選、藥物結(jié)合物活性綜合表征、仿制藥一致性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。由于基于SPR的生物分子相互作用分析儀已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于基礎(chǔ)生命科學(xué)研究和藥物研制等領(lǐng)域，使用單位包括了醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、食品與藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、生物醫(yī)藥研發(fā)單位、科研院所與高校等，檢測(cè)結(jié)果關(guān)乎藥物安全、生物安全、醫(yī)療安全，與大眾健康息息相關(guān)。尤其在治療性生物藥物的研發(fā)中，免疫應(yīng)答已成為影響安全的關(guān)鍵問題。新冠疫苗研發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中生物分子相互作用分析也起到關(guān)鍵作用。要保證基于SPR的生物分子相互作用分析的準(zhǔn)確可靠，其首要前提是量值的溯源性。而目前對(duì)此類儀器的量值溯源，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)通行的方法，我們有必要開展針對(duì)基于SPR的生物分子相互作用分析儀量值溯源技術(shù)的研究，從而來(lái)公正地評(píng)價(jià)儀器的各項(xiàng)性能指標(biāo)，保障基于SPR的生物分子相互作用分析儀的產(chǎn)品質(zhì)量以及測(cè)量結(jié)果的量值具有溯源性、準(zhǔn)確可靠。三、《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》制定過(guò)程1、2019年1月至2021年6月，校準(zhǔn)規(guī)范起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的校準(zhǔn)方法進(jìn)行了研究，研究了國(guó)內(nèi)使用面大的品牌的表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的工作原理及技術(shù)參數(shù)，對(duì)不同條件下測(cè)量?jī)x器的計(jì)量性能變化有深入的了解，為校準(zhǔn)規(guī)范的制定不僅積累了相當(dāng)多的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)而且創(chuàng)造了有力的條件。2、2021年7月，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局辦公廳批準(zhǔn)全國(guó)生物計(jì)量技術(shù)委員關(guān)于《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》的立項(xiàng)。上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院和中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院作為主要起草單位，上海市食品藥品檢驗(yàn)所、南京市計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)院、北京英柏生物科技有限公司參加起草，項(xiàng)目正式啟動(dòng)。上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院迅速抽調(diào)5名專業(yè)技術(shù)人員成立規(guī)范制定起草團(tuán)隊(duì)，全面落實(shí)編制工作。起草團(tuán)隊(duì)認(rèn)真制定了詳細(xì)的編制計(jì)劃、實(shí)施步驟、經(jīng)費(fèi)計(jì)劃、實(shí)驗(yàn)方案等。3、2021年7月至12月，起草團(tuán)隊(duì)認(rèn)真查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)等資料，3對(duì)表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的使用情況、主要原理、性能指標(biāo)等進(jìn)行了全面調(diào)研。4、2022年1月至5月，起草團(tuán)隊(duì)走訪了表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀生產(chǎn)廠家美國(guó)通用電氣醫(yī)療(GE)公司、北京英柏生物科技有限公司、賽多利斯(Sartorius)(上海)貿(mào)易有限公司以及使用單位上海市食品藥品檢驗(yàn)所、上海海路生物技術(shù)有限公司等企業(yè)，進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研。根據(jù)調(diào)研結(jié)果，就規(guī)范的架構(gòu)設(shè)定、校準(zhǔn)項(xiàng)目等廣泛聽取了相關(guān)專家的建議和意見。專家來(lái)自生產(chǎn)廠家、應(yīng)用客戶、儀器維修單位等各方面，提出了許多建設(shè)性的意見和建議。同時(shí)，起草團(tuán)隊(duì)申請(qǐng)立項(xiàng)了上海市市場(chǎng)監(jiān)督管理局科研項(xiàng)目《生物分子相互作用SPR檢測(cè)計(jì)量溯源技術(shù)研究》(2022-13)，為規(guī)范的制修訂提供了經(jīng)費(fèi)支持。5、2022年6月，起草團(tuán)隊(duì)開展多次討論，對(duì)規(guī)范的框架結(jié)構(gòu)、適用范圍、技術(shù)指標(biāo)要求等進(jìn)行研究，形成了《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》(草案)。2022年6月17日邀請(qǐng)了中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、江蘇省計(jì)量科學(xué)研究院、廣州省計(jì)量科學(xué)研究院、北京英柏生物科技有限公司等專家開展了規(guī)范制修訂討論會(huì)，與會(huì)專家給與了很多建設(shè)性的建議與意見，起草團(tuán)隊(duì)對(duì)《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》(草案)進(jìn)行修改和完善。6、2022年7月至2023年2月，起草團(tuán)隊(duì)到上海市食品藥品檢驗(yàn)所、上海海路生物技術(shù)有限公司、美國(guó)通用電氣醫(yī)療(GE)公司、北京英柏生物科技有限公司、賽多利斯(Sartorius)(上海)貿(mào)易有限公司等10多家單位做現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，分析判斷實(shí)驗(yàn)方案的可行性，排除不符合要求的試驗(yàn)方法，再制定新的試驗(yàn)方法和改進(jìn)意見，形成《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》(征求意見稿)。7、2023年3月至5月，起草團(tuán)隊(duì)將形成的《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》(征求意見稿)，發(fā)送至表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀生產(chǎn)及使用單位、科研院校等單位及相關(guān)專家，廣泛征求意見。起草團(tuán)隊(duì)根據(jù)專家意見，對(duì)《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》(征求意見稿)進(jìn)行修改和完善，形成送審稿。四、規(guī)范制定的主要技術(shù)依據(jù)與原則4(一)、技術(shù)依據(jù)《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》的制定參考了JJF1001《通用計(jì)量術(shù)語(yǔ)及定義》和JJF1059.1《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》等標(biāo)準(zhǔn)，按照J(rèn)JF1071《國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》的要求編制。(二)、原則根據(jù)JJF1071《國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》的要求，本規(guī)范構(gòu)架上包括封面、扉頁(yè)、目錄、引言、范圍、引用文件、概述、計(jì)量特性、校準(zhǔn)條件、校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法、校準(zhǔn)結(jié)果的表達(dá)、復(fù)校時(shí)間間隔、附錄等幾個(gè)部分。2、術(shù)語(yǔ)與計(jì)量單位的選擇術(shù)語(yǔ)和計(jì)量單位、計(jì)量特性、通用技術(shù)要求與校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法，原則上與JJF1071《國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》和JJF1001《通用計(jì)量術(shù)語(yǔ)及定義》保持一致。3、計(jì)量特性確定原則表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的理論依據(jù)是表面等離子共振 (surfaceplasmonresonance，SPR)隨金屬表面的折射率變化而變化，而折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比，如圖1所示，偏振光以一定角度范圍入射到鍍?cè)诓ＡП砻娴谋∧ど习l(fā)生全反射，會(huì)形成消逝波進(jìn)入光疏介質(zhì)，而在光疏介質(zhì)中又存在等離子波，當(dāng)符合表面等離子體共振波的激發(fā)條件時(shí)，兩波相遇就可能發(fā)生共振(圖1)。入射光的能量被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)反射強(qiáng)度最低值，即共振吸收峰，所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為共振波長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的入射角為共振角，當(dāng)金屬薄膜表面介質(zhì)不同時(shí)，共振角或共振波長(zhǎng)將改變，由此可獲得相關(guān)信息。SPR對(duì)附著在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率非常敏感，當(dāng)表面介質(zhì)的屬性改變或者附著量改變時(shí)，共振角會(huì)發(fā)生變化。因此，SPR譜(共振角的變化vs時(shí)間)能夠反映與金屬膜表面接觸的體系的變化。5圖1表面等離子共振(SPR)原理圖SPR生物作用分析儀工作原理是將其中一個(gè)反應(yīng)物(稱為配體)偶聯(lián)在傳感芯片表面，含有一個(gè)反應(yīng)物(稱作分析物)的樣品通過(guò)微流控控制系統(tǒng)以恒定的流速通過(guò)傳感芯片表面，分子間有結(jié)合解離反應(yīng)而導(dǎo)致傳感芯片表面分子濃度的變化，儀器通過(guò)測(cè)量SPR角的改變，繪制SPR譜圖，如圖2所示，基線噪聲和基線漂移直接影響儀器的檢測(cè)限，檢測(cè)限是儀器的關(guān)鍵計(jì)量性能指標(biāo)；SPR生物作用分析儀可以作為ELISA方法對(duì)活性蛋白進(jìn)行定量分析，線性相關(guān)性和測(cè)量重復(fù)性直接影響樣品定量準(zhǔn)確性。因此基線噪聲、基線漂移、線性相關(guān)性、檢測(cè)限和測(cè)量重復(fù)性是表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的關(guān)鍵計(jì)量性能指標(biāo)。在實(shí)際的計(jì)量校準(zhǔn)研究工作當(dāng)中，我們結(jié)合一定數(shù)量、具有代表性的不同型號(hào)、不同廠家生產(chǎn)的表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀上的實(shí)驗(yàn)，形成本規(guī)范確定的計(jì)量特性。6圖2基于SPR的生物分子相互作用分析方法示意圖4、校準(zhǔn)用儀器選擇的原則隨著SPR技術(shù)的迅速發(fā)展，表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的研制也得到了廣大的關(guān)注，已經(jīng)有了相當(dāng)成熟的產(chǎn)品。我們調(diào)研了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上主流的國(guó)內(nèi)外表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀，廠商主要集中在GE公司、Satourius公司和英柏公司等。表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀測(cè)量的是隨金屬表面的折射率變化而變化，目前我國(guó)雖然有GBW(E)130147~130151、GBW(E)130840~130842折射率溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但是其以有機(jī)物為原料，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，會(huì)損壞生物傳感芯片，而且特性量值是20℃時(shí)的折射率，而客戶常用SPR生物相互作用分析儀的25℃進(jìn)行樣品分析，溫度不一致，因此，不能用于此類儀器的校準(zhǔn)。GE公司、Satourius公司和英柏公司均采用蔗糖溶液作為質(zhì)量控制，目前，我國(guó)有系列蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)供選擇使用。由于客戶進(jìn)行分析互作分析時(shí)，常采用緩沖溶液作為流動(dòng)液，因此，我們選擇GBW10067蔗糖純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用客戶最常用的緩沖溶液進(jìn)行溶解稀釋，用做儀器檢出限的校準(zhǔn)。由于線性相關(guān)性校準(zhǔn)需要用一系列折射率水平的蔗糖溶液，如果采用GBW10067蔗糖純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(2g/瓶，450元/瓶)，需要成本高，我們選擇分析純的蔗糖試劑。采用客戶最常用的緩沖溶液進(jìn)行溶解稀釋，冷藏保存，使用經(jīng)過(guò)計(jì)量校準(zhǔn)的阿貝折射儀定值(25℃的折射率)后，用于儀器線性相7關(guān)性和重復(fù)性的校準(zhǔn)?；€漂移和基線噪聲的校準(zhǔn)采用客戶常用系統(tǒng)緩沖液即可，這樣可以反映客戶的實(shí)際使用情況。表1列舉了該儀器校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。表1校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)項(xiàng)目校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或試劑基線噪聲客戶常用系統(tǒng)緩沖液基線漂移線性相關(guān)性分析純的蔗糖試劑，采用客戶常用系統(tǒng)緩沖液溶解稀釋，用阿貝折射儀定值(25℃折射率)測(cè)量重復(fù)性檢測(cè)限GBW10067蔗糖純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用客戶常用系統(tǒng)緩沖液溶解稀釋，重量法配制10mg/g蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液五、規(guī)范制定說(shuō)明《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》共分為封面、扉頁(yè)、目錄、引言、范圍、引用文件、術(shù)語(yǔ)、概述、計(jì)量特性、校準(zhǔn)條件、校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法、校準(zhǔn)結(jié)果的表達(dá)、復(fù)校時(shí)間間隔、附錄。其中，封面、扉頁(yè)和目錄三個(gè)部分根據(jù)JJF1071《國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》撰寫。(一)、范圍本規(guī)范適用于基于表面等離子體共振原理的生物分子相互作用分析儀的校(二)、引用文件《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》主要參考了ISBN:9787030557223核醫(yī)學(xué)名詞完成本規(guī)范的制定。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范。(三)、術(shù)語(yǔ)本部分給出了結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)及親和力的定義和解釋。(四)、概述本部分主要對(duì)表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的儀器組成和工8作原理進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹。表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀(以下簡(jiǎn)稱分析儀)主要由微流控系統(tǒng)、傳感器芯片和光學(xué)系統(tǒng)三部分組成，可進(jìn)行生物分子的分子間結(jié)合的特異性、動(dòng)力學(xué)(結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù))、結(jié)合的強(qiáng)弱(親和力)以及結(jié)合的機(jī)理等分子間相互作用的高靈敏度檢測(cè)和分析。(五)、計(jì)量特性盡管基于SPR的生物分子相互作用分析儀已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)通行的計(jì)量校準(zhǔn)方法，我國(guó)尚未出臺(tái)有關(guān)基于SPR的生物分子相互作用分析儀的檢定規(guī)程或者校準(zhǔn)規(guī)范，只有儀器生產(chǎn)單位和使用單位對(duì)儀器質(zhì)量控制提出了些許思路：美國(guó)通用電氣醫(yī)療(GE)公司采用β球蛋白及其對(duì)應(yīng)抗體作為互作分子對(duì)儀器進(jìn)行性能評(píng)價(jià)；美國(guó)Fortebio公司采用甘油對(duì)儀器的響應(yīng)范圍進(jìn)行評(píng)價(jià)；武漢大學(xué)的劉課題組研究了陽(yáng)離子呋啉與牛血清白蛋白互作系統(tǒng)，對(duì)日常實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制；清華大學(xué)的余課題組設(shè)計(jì)了生物分子相互作用分析儀的自動(dòng)控制系統(tǒng)，并提出溫度控制的重要性。這些研究工作對(duì)定量評(píng)價(jià)基于SPR的生物分子相互作用分析儀的性能起到了積極的作用。然而，這些工作不足之處在于：使用蛋白及其抗體互作分子對(duì)或甘油受到實(shí)驗(yàn)條件和試劑本身質(zhì)量的影響，可靠性和穩(wěn)定性差，只能作為廠商內(nèi)部的質(zhì)量控制使用，無(wú)法用于不同廠家間的統(tǒng)一計(jì)量校準(zhǔn)，而且沒有明確的、可校準(zhǔn)的計(jì)量性能指標(biāo)。目前市場(chǎng)上主流的基于SPR的生物分子相互作用分析儀主要有：美國(guó)通用電氣醫(yī)療(GE)公司的BiacoreT200和Biacore8K型儀器；德國(guó)賽多利斯(Sartourius)公司的Pioneer、SF3型儀器；國(guó)內(nèi)英柏生物的MI-S200D等型號(hào)儀器。目前，表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀廣泛用于分子相互作用模式的研究、動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定、親和常數(shù)測(cè)定及濃度的測(cè)量等，主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究、癌癥研究、新藥研發(fā)、信號(hào)傳遞、分子識(shí)別、免疫調(diào)節(jié)、免疫測(cè)定法、疫苗開發(fā)、瞬時(shí)結(jié)合、配體垂釣、結(jié)合特異性、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及酶反應(yīng)等分析領(lǐng)域。本部分通過(guò)對(duì)表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀主要原理、性能指標(biāo)等全面調(diào)研以及表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀在實(shí)際中的使用情況確定了《表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》中的計(jì)量特9性。包括：基線噪聲、基線漂移、線性相關(guān)性、檢測(cè)限和測(cè)量重復(fù)性。1、基線噪聲和基線漂移基線噪聲和基線偏移是判斷表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀檢測(cè)性能和微流控流路清潔度和流速穩(wěn)定性最便捷的方法之一，儀器產(chǎn)生基線噪聲和基線偏移也是使用過(guò)程中一個(gè)正常的變化因素，一般廠家也都會(huì)有相應(yīng)的說(shuō)明。而且，基線噪聲和基線漂移也直接影響儀器的檢出限。一般生物分子相互作用都會(huì)在10分鐘內(nèi)完成，因此，我們采用分析儀系統(tǒng)緩沖溶液為樣本，記錄基線10分鐘，考察基線噪聲和基線偏移，如圖3所示。圖310分鐘SPR譜圖基線情況2、線性相關(guān)性SPR生物作用分析儀可以作為ELISA方法對(duì)活性蛋白進(jìn)行定量分析，線性優(yōu)良作為SPR生物作用分析儀儀器性能最基本最核心的指標(biāo)，我們采用一系列具有明確折射率值(25℃)的溶液進(jìn)行校準(zhǔn)，得到一系列SPR譜圖，如圖4所示，隨著折射率的增加，儀器讀出的信號(hào)逐漸增加，儀器信號(hào)值與折射率值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖5所示。圖4不同折射率溶液的SPR譜圖圖5不同折射率溶液的SPR信號(hào)與相應(yīng)的折射率值之間的線性關(guān)系檢測(cè)限是SPR生物分子相互作用分析儀的關(guān)鍵計(jì)量性能指標(biāo)，直接影響親和力的檢測(cè)范圍。由于儀器直接檢測(cè)SPR隨金屬表面的折射率變化而變化，不同濃度的蔗糖會(huì)引起儀器檢測(cè)信號(hào)的變化。由于客戶進(jìn)行分析互作分析時(shí)，采用緩沖溶液作為流動(dòng)液，緩沖溶液本身也由一定的折射率，也會(huì)引起儀器信號(hào)的增加，因此可以選擇蔗糖有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用客戶最常用的緩沖溶液進(jìn)行溶解稀釋，作為檢測(cè)限校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)一個(gè)完整的SPR譜圖中蔗糖引起的信號(hào)與基線信號(hào)來(lái)計(jì)算檢測(cè)限。對(duì)表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀重復(fù)性的校準(zhǔn)可以反應(yīng)儀器的狀況，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。因此，重復(fù)性是表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的一個(gè)非常重要的計(jì)量性能指標(biāo)。(六)、校準(zhǔn)條件本部分主要規(guī)定了表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)時(shí)需要滿足的、對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果有影響的環(huán)境條件和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。環(huán)境條件包括：溫度： Hz。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，主要包括儀器線性相關(guān)性校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液和儀器檢測(cè)限校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液。儀器線性相關(guān)性校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液：折射率溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，至少5個(gè)折射率水平，最小折射率＞1.330，最高折射率＜1.400，并且在折射率(1.330~1.440)范圍內(nèi)均勻覆蓋，相對(duì)擴(kuò)展不確定度≤0.1%，包含因子k=2?；虿捎梅治黾冋崽桥渲撇⒉捎冒⒇愓凵鋬x定值，配制和定值方法參考校準(zhǔn)規(guī)范附錄A。儀器檢測(cè)限校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液：使用蔗糖純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度≥99.7%，擴(kuò)展不確定度≤0.8%，包含因子k=2，用分析儀系統(tǒng)緩沖溶液配制成10mg/g的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制方法參考校準(zhǔn)規(guī)范附錄B。(七)、校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法主要針對(duì)表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀的特點(diǎn)，選擇一定數(shù)量的、不同型號(hào)的儀器進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)試。通過(guò)分析在一定數(shù)量、具有代表性的不同型號(hào)、不同廠家生產(chǎn)的表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，綜合表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀在實(shí)際應(yīng)用中的主要功能和性能指標(biāo)，考慮其具體應(yīng)用的要求，形成了本規(guī)范確定的校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法。本部分主要規(guī)定了表面等離子體共振生物分子相互作用分析儀校準(zhǔn)項(xiàng)目包括基線噪聲、基線漂移、線性相關(guān)性、檢測(cè)限和測(cè)量重復(fù)性。校準(zhǔn)方法(1)基線噪聲和基線漂移采用分析儀系統(tǒng)緩沖溶液為樣本，記錄基線10min，基線漂移用10min內(nèi)基線偏離起始點(diǎn)最大信號(hào)值(分析儀檢測(cè)器自身的物理量單位/10min)表示。選取基線中噪聲信號(hào)的最大值(Hmax，分析儀檢測(cè)器自身的物理量單位)，最小值(Hmin，分析儀檢測(cè)器自身的物理量單位)，按公式(1)計(jì)算基線噪聲(Nd)Nd=Hmax-Hmin(1)式中：Nd——基線噪聲，分析儀檢測(cè)器自身的物理量單位；Hmax——基線中噪聲信號(hào)的最大值，分析儀檢測(cè)器自身的物理量單位；Hmin——基線中噪聲信號(hào)的最小值，分析儀檢測(cè)器自身的物理量單位。(2)線性相關(guān)性采用含有至少5個(gè)折射率水平的儀器線性相關(guān)性校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照測(cè)試樣品的方法，記錄儀器信號(hào)值(分析儀檢測(cè)器自身的物理量單位)，重復(fù)進(jìn)樣3次，每次連續(xù)進(jìn)樣1min，取其平均值，將測(cè)量結(jié)果的平均值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值(或校準(zhǔn)溶液的折射率測(cè)定值)進(jìn)行線性回歸，用軟件進(jìn)行線性擬合或按公式(2)計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r作為線性相關(guān)性的表征。(2)r=(Xi