抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座

目錄第一節(jié)標(biāo)識(shí)物種類及特征第二節(jié)常見(jiàn)交聯(lián)劑種類及特征第三節(jié)放射性核素與抗原抗體結(jié)合物制備第四節(jié)熒光素與抗原抗體結(jié)合物制備第五節(jié)酶與抗原抗體結(jié)合物制備第六節(jié)化學(xué)發(fā)光劑與抗原抗體結(jié)合物制備第七節(jié)稀土離子與抗原抗體結(jié)合物制備第八節(jié)量子點(diǎn)與抗原抗體結(jié)合物制備第九節(jié)膠體金與抗原抗體結(jié)合物制備抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第1頁(yè)第一節(jié)標(biāo)識(shí)物種類及特征抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第2頁(yè)重點(diǎn)提醒放射性核素?zé)晒馕镔|(zhì)酶和酶作用底物化學(xué)發(fā)光劑量子點(diǎn)膠體金抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第3頁(yè)第一節(jié)標(biāo)識(shí)物種類及特征標(biāo)識(shí)免疫技術(shù)=免疫技術(shù)+標(biāo)識(shí)技術(shù)

抗原抗體反應(yīng)示蹤標(biāo)識(shí)物高特異性高靈敏性精密儀器檢測(cè)高精密性既能夠與抗原或抗體相結(jié)合，又能夠被對(duì)應(yīng)儀器所檢測(cè)物質(zhì)，這就是標(biāo)識(shí)物標(biāo)識(shí)物在免疫分析中作用在于示蹤標(biāo)識(shí)并能夠被檢測(cè)抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第4頁(yè)一、放射性核素在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化，由一個(gè)放射性核素轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€(gè)放射性核素，并同時(shí)釋放射線，這一轉(zhuǎn)變過(guò)程稱為放射性衰變。依衰變方式分為：α、β、γ。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第5頁(yè)一、放射性核素慣用標(biāo)識(shí)核素

125I3H理化性

活潑

差標(biāo)識(shí)方法簡(jiǎn)單復(fù)雜對(duì)標(biāo)識(shí)物免疫活性影響小大射線γβ半衰期60d12.3y測(cè)量條件簡(jiǎn)單復(fù)雜抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第6頁(yè)放射性核素125I特點(diǎn)化學(xué)性質(zhì)較活潑，標(biāo)識(shí)方法簡(jiǎn)單，輕易獲取高比活性標(biāo)識(shí)結(jié)合物；衰變過(guò)程不產(chǎn)生電離輻射強(qiáng)β射線，對(duì)標(biāo)識(shí)多肽，蛋白抗原分子免疫活性影響?。凰プ冞^(guò)程中釋放γ射線，可用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量，方法簡(jiǎn)便，易推廣應(yīng)用；半衰期(60天)適中、核素豐度(>95％)及計(jì)數(shù)率相對(duì)較高?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第7頁(yè)二、熒光物質(zhì)有機(jī)化合物熒光素稀土離子螯合物熒光底物（酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)）抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第8頁(yè)熒光素異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）四乙基羅丹明（rhodamine,RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）藻紅蛋白(phycoerthrin,PE)抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第9頁(yè)慣用熒光素特征熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC襯比染色或雙標(biāo)識(shí)FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC襯比染色或雙標(biāo)識(shí)FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)識(shí)FAT、流式細(xì)胞術(shù)抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第10頁(yè)稀土離子鑭系元素屬于三價(jià)稀土離子，包含銪（Eu3+）、釤（Sm3+）、鋱(Tb3+)、釹（Nd3+）、鏑（Dy3+）di和鈰(Ce3+)等。銪是標(biāo)識(shí)抗原抗體應(yīng)用最廣元素。游離稀土離子熒光比較弱，但與適當(dāng)螯合劑如β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA）等形成螯合物后，可使熒光得到增強(qiáng)。稀土離子熒光特征以下：含有較大Stokes位移，發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不會(huì)相互重合。熒光壽命長(zhǎng)，熒光半衰期介于10-1000μs之間。激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光譜帶很窄，甚至不到10nm?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第11頁(yè)其它熒光物質(zhì)一些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，但經(jīng)酶催化后便含有強(qiáng)熒光。如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶作用后分解成4-甲基傘酮，可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其它如堿性磷酸酶底物（4-甲基傘酮磷酸鹽）和辣根過(guò)氧化物酶底物（對(duì)羥基苯乙酸）等，都含有熒光底物性質(zhì)。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第12頁(yè)三、酶和酶作用底物慣用酶標(biāo)識(shí)物有辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)每種酶可與對(duì)應(yīng)顯色或發(fā)光底物作用，產(chǎn)生經(jīng)典有色反應(yīng)物或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，經(jīng)過(guò)反應(yīng)顏色或發(fā)光強(qiáng)度對(duì)被檢物進(jìn)行定性、定量分析?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第13頁(yè)辣根過(guò)氧化物酶HRP辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無(wú)關(guān)輔基是酶活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無(wú)關(guān)，酶活性單位比RZ值更為主要ELISA中應(yīng)用最為廣泛標(biāo)識(shí)用酶抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第14頁(yè)堿性磷酸酶ALP及β-半乳糖苷酶堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測(cè)定

抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第15頁(yè)HRP底物HRP底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有各種

H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體專一性很高

抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第16頁(yè)HRP常見(jiàn)底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS慣用底物抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第17頁(yè)OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛底物。

HRP常見(jiàn)底物

抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第18頁(yè)對(duì)羥基苯乙酸（4-hydroxyphenylaceticacid，HPA）HPA含有熒光底物性質(zhì)，在H2O2存在下被HRP氧化成二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長(zhǎng)熒光。H2O2HRP+熒光氧化二聚體抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第19頁(yè)ALP底物慣用ALP色原底物對(duì)-硝基苯磷酸鹽（p-nitrophenylphosphate，PNP）氯化硝基四氮唑藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（nitro-blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate，BCIP/NBT）4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-methylumbelliferylphosphate，4-MUP）是ALP發(fā)光底物之一。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第20頁(yè)ALP底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。

慣用底物BCIP/NBT慣用于ELISPOT中PVDF膜顯色，在ALP催化作用下，BCIP被水解生成強(qiáng)反應(yīng)性產(chǎn)物，該產(chǎn)物與NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性深藍(lán)色至藍(lán)紫色沉淀抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第21頁(yè)4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm熒光，可用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。熒光AP360nm激發(fā)光H3PO4+抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第22頁(yè)β-Gal熒光底物β-Gal底物

4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測(cè)量。慣用4-甲基傘酮基-β-D半乳糖（4-methylumbellifery-β-D-galactoside，4-MUG）作為底物，酶促反應(yīng)后，產(chǎn)生高強(qiáng)度熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮（4-MU）。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第23頁(yè)四、化學(xué)發(fā)光劑在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參加能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子形式釋放能量化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。直接化學(xué)發(fā)光劑酶促反應(yīng)發(fā)光劑抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第24頁(yè)直接化學(xué)發(fā)光劑直接化學(xué)發(fā)光劑直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需酶催化作用，直接參加發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光特有基團(tuán)，可直接標(biāo)識(shí)抗原或抗體。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第25頁(yè)吖啶酯在堿性條件下與H2O2

就可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。在堿性介質(zhì)中氧化時(shí)，這些化合物經(jīng)歷共價(jià)鍵斷裂，經(jīng)過(guò)一個(gè)二氧酮中間體，產(chǎn)生電激發(fā)N-甲基吖啶酮，當(dāng)它恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，在430nm出釋放出光子?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第26頁(yè)AE特征化學(xué)發(fā)光反應(yīng)簡(jiǎn)單，無(wú)需催化劑，背景噪聲低。極其穩(wěn)定，如2-甲基吖啶酯，因其獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其使用期長(zhǎng)達(dá)1年甚至更久。發(fā)光過(guò)程快速，1秒內(nèi)光子散射達(dá)高峰，整個(gè)過(guò)程在2秒內(nèi)完成?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第27頁(yè)電化學(xué)發(fā)光劑是指經(jīng)過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光物質(zhì)。特點(diǎn)：①反應(yīng)在電極進(jìn)行；②電子供體為：三丙胺（TPA）③化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第28頁(yè)電化學(xué)發(fā)光劑抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第29頁(yè)酶促反應(yīng)發(fā)光劑酶促反應(yīng)發(fā)光劑：是利用標(biāo)識(shí)酶催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。魯米諾及其衍生物AMPPD抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第30頁(yè)魯米諾及其衍生物魯米諾發(fā)光原理抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第31頁(yè)魯米諾及其衍生物魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第32頁(yè)AMPPDAMPPD〔3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第33頁(yè)五、量子點(diǎn)抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第34頁(yè)量子點(diǎn)QDs量子點(diǎn)(quantimimdots,QDs)即半導(dǎo)體納米粒子，是指半徑小于或靠近于激子玻爾半徑半導(dǎo)體納米晶粒（1-10nm）。由II-VI族或III-V族元素組成，性質(zhì)穩(wěn)定，可接收激發(fā)光產(chǎn)生熒光，含有類似體相晶體規(guī)整原子排布。廣義量子點(diǎn)還包含IV-VI族、V-VI族元素組成納米晶，以及金簇、銀簇、硅點(diǎn)、碳點(diǎn)、復(fù)合型熒光納米顆粒等?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第35頁(yè)量子點(diǎn)光學(xué)特征熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，抗漂白能力強(qiáng)所謂光漂白是指由光激發(fā)引發(fā)發(fā)光物質(zhì)分解而使熒光強(qiáng)度降低現(xiàn)象。有機(jī)熒光色素光漂白速率很快，而量子點(diǎn)光漂白作用則小得多。含有“調(diào)色”功效，一元激發(fā)多元發(fā)射不一樣粒徑量子點(diǎn)含有不一樣顏色，可用同一波長(zhǎng)光激發(fā)不一樣大小量子點(diǎn)，取得各種標(biāo)識(shí)顏色。激發(fā)光波長(zhǎng)寬，而發(fā)射光波長(zhǎng)窄量子點(diǎn)激發(fā)光波長(zhǎng)范圍很寬，含有較大Stokes位移和狹窄對(duì)稱熒光譜峰?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第36頁(yè)量子點(diǎn)調(diào)色功效在紫外光激發(fā)下，相同組成不一樣粒徑量子點(diǎn)發(fā)射光譜抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第37頁(yè)量子點(diǎn)制備大致分為兩種方法：物理制備法、化學(xué)合成法。物理制備法可制得粒徑易控量子點(diǎn)，但所需試驗(yàn)設(shè)備昂貴，廣泛使用受限?；瘜W(xué)合成法有水相和有機(jī)相合成法有機(jī)相體系

可制備性能優(yōu)良量子點(diǎn)，如CdSe及CdSe/ZnS。

量子點(diǎn)分散性好、穩(wěn)定性高、不易沉積，但水溶性太差。水相體系

操作簡(jiǎn)單、成本低廉、量子點(diǎn)表面形貌及性質(zhì)可控、易修飾各種基團(tuán)?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第38頁(yè)量子點(diǎn)表面修飾無(wú)機(jī)殼層修飾法和化學(xué)修飾法是兩種慣用量子點(diǎn)修飾方法。無(wú)機(jī)殼層修飾法合成核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)，如在CdSe量子點(diǎn)外面包覆一層CdS或ZnS就組成了以CdSe為核，以CdS或ZnS為殼量子點(diǎn)。化學(xué)修飾法用含巰基有機(jī)分子如二氫硫辛酸、巰基乙酸和聚乙二醇等對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行表面修飾?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第39頁(yè)六、膠體金膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠，是金鹽被還原成金原子后形成金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核(原子金Au)及包圍在外雙離子層組成(內(nèi)層為負(fù)離子層AuCl2-，外層是帶正電荷H+)。因?yàn)殪o電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一個(gè)穩(wěn)定膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電疏水膠溶液，故稱膠體金。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第40頁(yè)膠體金特征含有膠體各種特征尤其是對(duì)電解質(zhì)敏感性，電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒外周水化層，從而打破膠體金穩(wěn)定狀態(tài)。膠體金顆粒大小不一樣，呈色不一樣，光吸收性也不一樣最小膠體金(2nm～5nm)是橙黃色，中等大小膠體金(10nm～20nm)是酒紅色，較大顆粒膠體金(30nm～80nm)則是紫紅色。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第41頁(yè)膠體金制備原理膠體金是氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，聚合成一定大小金顆粒，形成帶負(fù)電荷疏水膠溶液。慣用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、維生素C、白磷、硼氫化鈉等。依據(jù)還原劑類型以及還原作用強(qiáng)弱，能夠制備0.8nm～150nm不等膠體金顆粒?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第42頁(yè)膠體金制備方法慣用方法為檸檬酸三鈉還原法以制備16nm膠體金為例，取0.01%氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，磁力攪動(dòng)下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2ml，淡黃色氯金酸溶液很快變灰色，繼而黑色，隨即成酒紅色。金溶膠顆粒直徑取決于制備時(shí)加入枸櫞酸三鈉量，保持其它條件不變，制備時(shí)加入不一樣劑量檸檬酸三鈉可取得不一樣粒徑膠體金顆粒。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第43頁(yè)第二節(jié)慣用交聯(lián)劑及特征抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第44頁(yè)重點(diǎn)提醒均一雙功效交聯(lián)劑非均一雙功效交聯(lián)劑交聯(lián)劑方法抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第45頁(yè)交聯(lián)劑生物大分子之間偶聯(lián)，本質(zhì)上是生物大分子中活性基團(tuán)之間連接。其連接類型主要有：-NH2與-NH2

、-NH2與-CO2H、-SH與-SH、-NH2與-SH、糖基(-OH)與-NH2

、-C=O與-NH2

等。免疫標(biāo)識(shí)慣用交聯(lián)劑分子兩端各有一個(gè)相同或者不一樣活性基團(tuán)，它們可與其它分子上氨基、巰基、羥基等基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合而產(chǎn)生交聯(lián)作用?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第46頁(yè)交聯(lián)劑類型依據(jù)其兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是否相同分為均一和非均一交聯(lián)試劑。均一雙功效交聯(lián)劑，其兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)相同。非均一雙功效交聯(lián)劑，兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)不一樣，每個(gè)基團(tuán)可能于不一樣條件下反應(yīng)。大分子抗原、抗體標(biāo)識(shí)是利用雙功效交聯(lián)劑使標(biāo)識(shí)物與被標(biāo)識(shí)物結(jié)構(gòu)中游離氨基、羧基、硫氫基、咪唑基、酚基、羥基等基團(tuán)形成不可逆連接?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第47頁(yè)一、均一雙功效交聯(lián)劑

慣用均一雙功效交聯(lián)劑（homobifunctionalcross-linkingreagent）有戊二醛、碳二亞胺等。有-CHO、-N=C=O、-N=C=S、-SO2CH=CH2

等活潑雙鍵,可與生物大分子中-NH2

、-OH、-SH等進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。原理簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫和，適用范圍廣；

副反應(yīng)較多,易發(fā)生多聚合和分子內(nèi)交聯(lián)，使交聯(lián)物生物活性顯著下降?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第48頁(yè)碳二亞胺縮正當(dāng)碳二亞胺能激活蛋白質(zhì)分子上羧基，反應(yīng)生成一個(gè)肽鍵（-CO-NH-），經(jīng)碳二亞胺縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中游離羧基與標(biāo)識(shí)物分子中氨基形成較穩(wěn)定酰胺鍵?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第49頁(yè)戊二醛法戊二醛分子中兩個(gè)醛基可分別與兩個(gè)相同或不一樣分子上伯氨形成Schiff堿,將兩個(gè)生物大分子以五碳鏈橋連接起來(lái)?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第50頁(yè)過(guò)碘酸鈉氧化法利用過(guò)碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基鄰二羥基成為醛基，再經(jīng)過(guò)醛基與標(biāo)識(shí)物分子中伯氨基反應(yīng)形成schiff堿，后者經(jīng)NaBH4還原—N＝C—鍵成為穩(wěn)定結(jié)合物?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第51頁(yè)N-羥基琥珀酰亞胺活化法

蛋白質(zhì)分子羧基經(jīng)過(guò)N-羥基琥珀亞酰胺活化，再與標(biāo)識(shí)物分子中氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第52頁(yè)非均一雙功效交聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸醋(SPDP)等屬于非均一雙功效交聯(lián)劑(heterobifunctionalcross-linkingreagent)。SPDP分子兩端分別含有對(duì)脂肪鏈上巰基和伯氨基十分敏感，有專一作用二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基，可將含巰基和氨基兩種蛋白質(zhì)很輕易地交聯(lián)起來(lái)；假如兩種蛋白質(zhì)不含巰基，可用SPDP在其中一個(gè)蛋白質(zhì)分子中引入二硫吡啶基，然后再用二巰基蘇糖醇（DTT）還原成游離巰基，最終使二者交聯(lián)起來(lái)?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第53頁(yè)SPDP分子結(jié)構(gòu)式抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第54頁(yè)SPDP交聯(lián)原理將蛋白質(zhì)（P1-NH2）經(jīng)過(guò)酰胺化學(xué)反應(yīng)，引入二硫吡啶基（DTP）。將DTP化蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)T-DE反應(yīng)，與含巰基蛋白質(zhì)（P2-SH）進(jìn)行交聯(lián)。假如第二種蛋白質(zhì)分子（P2）不含巰基，可按反應(yīng)（1）而得到P2-NH-DTP，再與二巰基蘇糖醇（DTT）起反應(yīng)，將DTP基還原成巰基，所得P2NHCOCH2CH2SH，再按反應(yīng)（2）方式交聯(lián)，制得結(jié)合物II（P1-NHCOCH2CH2SSCH2CH2CONHP2）?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第55頁(yè)SPDP交聯(lián)法優(yōu)點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)伯胺基和脂肪族鏈上游離巰基反應(yīng)敏感，專一性很強(qiáng)，反應(yīng)輕易控制，可防止副反應(yīng)。交聯(lián)程度輕易測(cè)定，交聯(lián)后大分子生物活性高于普通交聯(lián)劑方法?？山?jīng)過(guò)還原裂解使其再生?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第56頁(yè)第三節(jié)放射性核素與抗原抗體結(jié)合物制備抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第57頁(yè)重點(diǎn)提醒標(biāo)識(shí)物與抗原抗體結(jié)合物制備基本方法標(biāo)識(shí)物與抗原抗體結(jié)合物純化標(biāo)識(shí)物與抗原抗體結(jié)合物判定標(biāo)識(shí)物與抗原抗體結(jié)合物保留抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第58頁(yè)放射性核素與抗原抗體結(jié)合物制備

一、基本方法氯胺T(ch-T)法是慣用標(biāo)識(shí)方法，氯胺T是一個(gè)氧化劑，它能使125I+液中帶負(fù)電荷碘離子氧化成帶正電荷碘，然后取代抗原酪氨酸殘基芳香環(huán)上氫ch-T是對(duì)甲苯磺基酰胺N-氯衍生物鈉鹽，在水中易分解成具氧化性次氯酸：次氯酸可將125I﹣氧化成帶正電荷125I+，后者可取代抗原（或抗體）中酪氨酸殘基苯環(huán)上氫原子，形成穩(wěn)定放射標(biāo)識(shí)物；最終加入還原劑偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）可終止反應(yīng)抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第59頁(yè)125I結(jié)合物制備直接標(biāo)識(shí)法—氯胺T法化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放射性負(fù)電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，經(jīng)過(guò)取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上氫原子。

125I-Ch-T氧化125I或125I+取代反應(yīng)125I-標(biāo)識(shí)物（混合物）抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第60頁(yè)氯胺T(ch-T)法使用無(wú)還原劑高比放射性碘源ch-T用量要低控制總反應(yīng)體積<200μl反應(yīng)時(shí)間1分鐘～2分鐘弱堿性反應(yīng)條件抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第61頁(yè)二、放射性核素標(biāo)識(shí)結(jié)合物純化標(biāo)識(shí)反應(yīng)后形成結(jié)合物不能直接使用，需去除游離125I和其它雜質(zhì)。游離125I和125I標(biāo)識(shí)抗體（抗原）分子大小相差懸殊，采取凝膠層析即可分離，如葡聚糖凝膠（SephadexG-50）柱層析?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第62頁(yè)125I結(jié)合物純化凝膠過(guò)濾法離子交換層析法聚丙烯酰胺凝膠電泳高效液相色譜法

去除游離125I去除過(guò)分標(biāo)識(shí)標(biāo)識(shí)物抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第63頁(yè)三、放射性核素標(biāo)識(shí)結(jié)合物判定放射性核素結(jié)合物判定包含放射化學(xué)純度、比放射活性和免疫活性三個(gè)參數(shù)：放射化學(xué)純度指在標(biāo)識(shí)物中結(jié)合在抗原（或抗體）上放射活性占該標(biāo)識(shí)物總放射活性百分比。比放射活性是指單位質(zhì)量標(biāo)識(shí)物中所含放射性強(qiáng)度，也可了解為每分子抗原（或抗體）平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目，慣用Ci/g或Ci/mmol表示。免疫活性指標(biāo)識(shí)物與抗原或抗體反應(yīng)能力。免疫活性測(cè)定方法，用少許標(biāo)識(shí)物與過(guò)量抗體反應(yīng)，測(cè)定與抗體結(jié)合部分（B）放射活性，并計(jì)算與加入標(biāo)識(shí)物總放射活性（T）百分比（B/T）?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第64頁(yè)125I結(jié)合物判定

標(biāo)識(shí)物質(zhì)量高純度高比放射活性完整免疫活性

放射化學(xué)純度單位標(biāo)識(shí)物中結(jié)合于抗原或抗體上放射活性占該標(biāo)識(shí)物總放射性百分比應(yīng)大于95%

免疫活性（immunoreactivity）標(biāo)識(shí)物與抗原或抗體結(jié)合能力標(biāo)識(shí)物與過(guò)量抗體反應(yīng)百分比該值越大,標(biāo)識(shí)物免疫活性好

抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第65頁(yè)四、放射性核素標(biāo)識(shí)結(jié)合物保留

放射性核素標(biāo)識(shí)結(jié)合物在2~8℃避光保留。注意放射防護(hù)，廢棄物須按放射防護(hù)條例要求處理。標(biāo)識(shí)物長(zhǎng)久貯存后可因脫碘和本身輻射造成蛋白質(zhì)破壞而形成碎片，一樣能夠采取上述方法對(duì)標(biāo)識(shí)物重新進(jìn)行純化。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第66頁(yè)第四節(jié)熒光素與抗原抗體結(jié)合物制備抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第67頁(yè)一、基本方法熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)主要有三種類型：?；?，由磺酸制備。異硫氰酸和重氮鹽類，這兩種通常由對(duì)應(yīng)胺制備，經(jīng)過(guò)化學(xué)鍵作用于對(duì)應(yīng)抗原、抗體反應(yīng)結(jié)合。當(dāng)前標(biāo)識(shí)方法主要是透析法和攪拌法兩種：以FITC標(biāo)識(shí)抗體（IgG）為例：FITC含有異硫氰基，在堿性條件下能與IgG自由氨基結(jié)合，形成熒光抗體結(jié)合物。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第68頁(yè)FITC標(biāo)識(shí)結(jié)合物制備熒光素標(biāo)識(shí)抗體方法原理:利用抗體蛋白自由氨基與FITC異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。標(biāo)識(shí)方法:攪拌法：適于標(biāo)識(shí)體積較大、蛋白含量較高抗體。標(biāo)識(shí)時(shí)間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。透析法：適于標(biāo)識(shí)樣品量少，蛋白含量低抗體。標(biāo)識(shí)比較勻，非特異染色較低。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第69頁(yè)透析法抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第70頁(yè)二、熒光素標(biāo)識(shí)結(jié)合物純化抗體標(biāo)識(shí)完成后，還應(yīng)對(duì)標(biāo)識(shí)抗體進(jìn)行純化，以除去未結(jié)合游離熒光素，純化方法可采取透析法和凝膠過(guò)濾法。透析法將標(biāo)識(shí)抗體放入透析袋中，不停更換透析液透析1周左右，直至透析液在紫外燈照射下不發(fā)出熒光為止，本法適合用于蛋白含量低標(biāo)識(shí)物。

凝膠過(guò)濾法將標(biāo)識(shí)抗體經(jīng)過(guò)SephadexG25或G50凝膠柱，洗脫第一峰為熒光素標(biāo)識(shí)抗體峰，第二峰為游離熒光素峰，搜集第一峰即可。本法簡(jiǎn)便快捷，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第71頁(yè)三、熒光素標(biāo)識(shí)結(jié)合物純化熒光抗體純化去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過(guò)濾去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過(guò)分抗體：陰離子交換層析法去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動(dòng)物肝粉吸收或固相抗原吸收抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第72頁(yè)熒光素標(biāo)識(shí)結(jié)合物判定熒光抗體判定熒光素與蛋白結(jié)合率

F/P=抗體效價(jià)：雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)抗體特異性：吸收試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)保留：-20℃：保留1年～2年真空干燥：長(zhǎng)久保留抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第73頁(yè)第五節(jié)酶與抗原抗體結(jié)合物制備抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第74頁(yè)普通是經(jīng)過(guò)交聯(lián)劑將酶與抗體或抗原相結(jié)合。交聯(lián)方法主要有：戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亞胺法、混合酸酐法等。普通都是利用小分子上活性部位與蛋白質(zhì)上氨基、羧基、酚基、巰基或羥基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第75頁(yè)一、基本方法制備方法過(guò)碘酸鈉法（直接法）慣用于HRP標(biāo)識(shí)抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個(gè)相同醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)識(shí)效率比一步法高，酶標(biāo)識(shí)物質(zhì)量較均一。過(guò)量戊二醛+酶酶-戊二醛-抗體（抗原）洗滌Ab/Ag抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第76頁(yè)戊二醛交聯(lián)法戊二醛為同源雙功效交聯(lián)劑，它有兩個(gè)相同醛基，可分別與酶分子和抗體(抗原)分子上氨基結(jié)合。戊二醛法又依據(jù)試劑加入方法分為一步法和二步法。一步法是將抗體(抗原)、酶和戊二醛同時(shí)發(fā)生反應(yīng)。此法操作簡(jiǎn)便，可用于HRP、ALP標(biāo)識(shí)抗體(抗原)。但酶標(biāo)識(shí)物產(chǎn)率低，酶標(biāo)識(shí)物易聚合，而且酶與酶、抗體與抗體之間也會(huì)發(fā)生交聯(lián)，影響標(biāo)識(shí)物質(zhì)量?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第77頁(yè)戊二醛交聯(lián)法二步法則是將相對(duì)過(guò)量戊二醛與酶反應(yīng)，讓酶分子上氨基僅與戊二醛上醛基結(jié)合，不發(fā)生酶與酶之間結(jié)合，除去未與酶結(jié)合多出戊二醛后，再加入抗體(抗原)，形成酶-戊二醛-抗體(抗原)結(jié)合物。其特點(diǎn)是酶標(biāo)識(shí)物均一，標(biāo)識(shí)效率也較一步法提升。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第78頁(yè)改良過(guò)碘酸鈉法此法是當(dāng)前用于HRP標(biāo)識(shí)抗體或抗原最慣用方法。過(guò)碘酸鈉可將與酶活性無(wú)關(guān)多糖羥基氧化為醛基，后者與抗體蛋白中游離氨基結(jié)合形成Schiff堿，再加入硼氫化鈉還原后，即生成穩(wěn)定酶標(biāo)識(shí)物。為預(yù)防酶蛋白分子中氨基與醛基發(fā)生本身偶聯(lián)反應(yīng)，標(biāo)識(shí)前需用2,4-二硝基氟苯封閉酶蛋白分子中殘余α-氨基和ε-氨基?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第79頁(yè)二、酶標(biāo)識(shí)結(jié)合物純化標(biāo)識(shí)完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，防止游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度。慣用純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過(guò)柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第80頁(yè)三、酶標(biāo)識(shí)結(jié)合物判定每批制備酶標(biāo)識(shí)物都要進(jìn)行質(zhì)量和標(biāo)識(shí)率判定，質(zhì)量判定包含酶活性和抗體（抗原）免疫活性判定。慣用判定方法：免疫電泳或雙相擴(kuò)散法慣用免疫電泳或雙向擴(kuò)散法，出現(xiàn)沉淀線表示酶標(biāo)識(shí)物中抗體（抗原）含有免疫活性。沉淀線經(jīng)生理鹽水重復(fù)漂洗后，滴加底物溶液，若能在沉淀線上顯色，則表示酶標(biāo)識(shí)物中酶仍含有活性。也可直接用ELSIA方法測(cè)定酶標(biāo)識(shí)率測(cè)定慣用分光光度計(jì)法分別測(cè)定酶標(biāo)識(shí)物中酶和抗體（抗原）蛋白含量，再用公式計(jì)算其標(biāo)識(shí)率?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第81頁(yè)四、酶標(biāo)識(shí)結(jié)合物保留

酶標(biāo)抗體中酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保留不妥，極易失活。高濃度結(jié)合物較為穩(wěn)定，冷凍干燥后可在普通冰箱中保留一年左右，但凍干過(guò)程中引發(fā)活力減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)融。結(jié)合物溶液中加入等體積甘油可在低溫冰箱或普通冰箱冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保留。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第82頁(yè)第六節(jié)化學(xué)發(fā)光劑與抗原抗體結(jié)合物制備抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第83頁(yè)一、基本方法化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)識(shí)反應(yīng)分為直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)兩種方式：直接偶聯(lián)是經(jīng)過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)，使標(biāo)識(shí)物分子中發(fā)光集團(tuán)直接連接到被標(biāo)識(shí)物分子反應(yīng)基團(tuán)上。間接偶聯(lián)是經(jīng)過(guò)交聯(lián)劑在標(biāo)識(shí)物和被標(biāo)識(shí)物之間插入一條鏈或一個(gè)基團(tuán)，經(jīng)過(guò)“橋”能夠在原有結(jié)構(gòu)中引進(jìn)新活性基團(tuán)，增加反應(yīng)活性，減弱偶聯(lián)雙方分子結(jié)構(gòu)中存在空間妨礙效應(yīng)。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第84頁(yè)二、化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)識(shí)結(jié)合物純化

多數(shù)經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)制備結(jié)合物，使用前需采取透析法、凝膠過(guò)濾法或鹽析沉淀法等進(jìn)行純化，目標(biāo)是除去反應(yīng)系統(tǒng)中存在未結(jié)合發(fā)光劑和交聯(lián)劑?？贵w的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第85頁(yè)三、化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)識(shí)結(jié)合物判定因?yàn)闃?biāo)識(shí)過(guò)程不規(guī)范或存放過(guò)程中可能出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，對(duì)新制備已純化或經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保留結(jié)合物，在使用前均需測(cè)定蛋白質(zhì)含量、免疫學(xué)活性和發(fā)光效率等三項(xiàng)指標(biāo)，以確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第86頁(yè)四、化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)識(shí)結(jié)合物保留

結(jié)合物普通可分裝保留在-70~4℃條件下，最好冷凍干燥保留，這么可保留多年之久不喪失活性。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第87頁(yè)第七節(jié)稀土離子與抗原抗體結(jié)合物制備抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第88頁(yè)一、基本方法鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體分子結(jié)合，需利用含有雙功效基團(tuán)螯合劑。慣用雙功效螯合劑有1-（對(duì)-苯偶氮）-EDTA、異硫氰酸苯基-EDTA、異硫氰酸苯甲基-EDTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等。螯合劑可先螯合EU3+，再連接蛋白質(zhì)（一步法），或先連接蛋白質(zhì)，再螯合EU3+(二步法)。針對(duì)小分子半抗原，則需先將半抗原與大分子載體蛋白（牛血清白蛋白、多聚賴氨酸等）連接，再標(biāo)識(shí)EU3+。抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第89頁(yè)第八節(jié)量子點(diǎn)與抗原抗體結(jié)合物制備抗體的標(biāo)記醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第90頁(yè)一、基本方法量子點(diǎn)與抗原、抗體等生物分子偶聯(lián)方法主要有靜電吸附法、生物素-親和素法及共價(jià)結(jié)正