基因工程PCR的學(xué)習(xí)課件

基因工程PCR的學(xué)習(xí)課件第1頁(yè)/共13頁(yè)

反應(yīng)需要兩條合成的寡核苷酸片段和耐熱的DNA聚合酶。一般用TaqDNA聚合酶，是從棲熱水生菌（Thermusaquaticus

）中提取出來(lái)的。兩條引物分別和正義鏈和反義鏈的3’端結(jié)合，然后朝著彼此的3’-OH方向延伸。PolymeraseChainReaction（PCR）

第2頁(yè)/共13頁(yè)P(yáng)olymeraseChainReaction（PCR）

947256

反應(yīng)的第一步是加熱DNA到95oC進(jìn)行變性（denature）使雙鏈解離為單鏈，解除變性條件后在較低的溫度50oC下引物退火（annealed）結(jié)合到目標(biāo)序列上，然后在72oC下，在dNTPs存在的情況下，DNA聚合酶運(yùn)用使引物序列延伸（extends

）。熱穩(wěn)定的酶不僅可以使DNA快速合成,而且在較寬的溫度范圍內(nèi)都能催化DNA合成。三個(gè)步驟：變性,退火和延伸

PCR循環(huán):一般25-40個(gè)循環(huán).每個(gè)循環(huán)都使目標(biāo)序列翻倍從而PCR可以快速擴(kuò)增第3頁(yè)/共13頁(yè)P(yáng)olymeraseChainReaction（PCR）

第4頁(yè)/共13頁(yè)第5頁(yè)/共13頁(yè)P(yáng)CR擴(kuò)增過(guò)程中片段增殖的計(jì)算

隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，長(zhǎng)鏈目標(biāo)片段增加的值為2(n+1),而短鏈目標(biāo)片段則以幾何倍數(shù)增加值為2(n+1)–2(n+1)。

20個(gè)循環(huán)后,目標(biāo)片段大約增加1百萬(wàn)倍。第6頁(yè)/共13頁(yè)P(yáng)CR使用的引物需特異性與目標(biāo)序列匹配，如果引物與DNA分子的其他部位結(jié)合,非特異擴(kuò)增將產(chǎn)生。引物與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合取決于溫度,每對(duì)引物最適的溫度要通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得。寡核苷酸引物的長(zhǎng)度一般為20-25個(gè)堿基，GC含量一般為50%左右，這樣退火溫度在52-58oC之間。很長(zhǎng)的寡核苷酸引物或高的GC含量需要很高的溫度，而短的寡核苷酸引物或低的GC含量則需要較低的溫度。對(duì)于17-25個(gè)堿基的引物,Tm的計(jì)算為:

最適的退火溫度一般比Tm低3-5oC。Primerdesignandcycleoptimization第7頁(yè)/共13頁(yè)1、所設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度范圍為18-27堿基，最長(zhǎng)不超過(guò)38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

2、引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則會(huì)容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3'端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)率增加。引物退火溫度在50-70℃之間，上下引物之間退火溫度相差不超過(guò)5℃。

3、GC含量在40-60%之間，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。

4、3'末端最好不是A，3'末端為A的錯(cuò)配效率明顯高于其它三個(gè)堿基。引物設(shè)計(jì)原則第8頁(yè)/共13頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)體系的確立WaterBuffer（10×）Mg++（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Templets12.821.60.4110.211282016410102…20uL反應(yīng)體系中各成分的母液濃度及加入量PCR擴(kuò)增程序舉例Tem.94℃94℃56℃72℃72℃Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles――35――第9頁(yè)/共13頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)的應(yīng)用

廣泛應(yīng)用于科研和實(shí)際檢測(cè)中，用于DNA研究、序列分析、基因表達(dá)測(cè)定、從cDNA庫(kù)放大特定克隆、構(gòu)建基因圖、進(jìn)化分析、生物證據(jù)分析、醫(yī)學(xué)研究與臨床檢驗(yàn)、性別控制、轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)等。第10頁(yè)/共13頁(yè)P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果分析舉例M1234567MM,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5-6,PCRforlectingene;7,N