土壤有機(jī)農(nóng)藥污染微生物修復(fù)及降解菌基因工程研究進(jìn)展

土壤有機(jī)農(nóng)藥污染微生物修復(fù)及降解菌基因工程研究進(jìn)展第1頁/共22頁摘要農(nóng)藥是一類重要的環(huán)境污染物，給全球生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重問題。微生物修復(fù)技術(shù)是利用微生物的生命活動(dòng)對有機(jī)農(nóng)藥的降解作用使受污染土壤恢復(fù)到健康狀態(tài)的過程。本文綜述了微生物強(qiáng)化修復(fù)的研究熱點(diǎn)問題及農(nóng)藥降解菌篩選和降解途徑的研究，并闡述了農(nóng)藥降解基因工程菌構(gòu)建研究中所存在的問題。第2頁/共22頁引言有機(jī)農(nóng)藥是人們主動(dòng)投放于環(huán)境中數(shù)量最大、毒性最廣的一類化學(xué)物質(zhì)。許多農(nóng)藥對人和非靶動(dòng)物具有內(nèi)分泌干擾作用、“三致”作用（致癌、致畸和致突變）或潛在“三致”作用。無論采用什么方式施藥，大部分有機(jī)農(nóng)藥都直接進(jìn)入土壤，農(nóng)藥的長期施用已使土壤環(huán)境受到普遍污染。。在生態(tài)系統(tǒng)中，微生物對環(huán)境中殘留農(nóng)藥的降解起著重要的作用。從自然環(huán)境中馴化和篩選出來的土著微生物對農(nóng)藥有一定的降解作用，但是其降解效率受微生物對污染物降解能力和諸多環(huán)境條件的限制。因而，人們引入一項(xiàng)新興的生物技術(shù)——構(gòu)建高效基因工程菌，來提高對污染物的降解效率和適應(yīng)各種環(huán)境條件。第3頁/共22頁1有機(jī)農(nóng)藥污染土壤的微生物修復(fù)概述1.1微生物修復(fù)概述微生物修復(fù)是利用微生物的生命代謝活動(dòng)減少土壤環(huán)境中有毒有害物的濃度，使受污染土壤恢復(fù)到健康狀態(tài)的過程。微生物修復(fù)技術(shù)可分為：原位修復(fù)、現(xiàn)場修復(fù)和異位修復(fù)第4頁/共22頁1.2生物強(qiáng)化技術(shù)在具體修復(fù)工程中，如果土壤中的土著微生物不能滿足要求(如降解效率太低等)，就要采用生物強(qiáng)化技術(shù)。生物強(qiáng)化技術(shù)就是用改良微生物組成來改善對污染物的處理效果。第5頁/共22頁目前的生物強(qiáng)化技術(shù)主要是指在生物處理系統(tǒng)中投加具有特定功能的微生物來改善原有系統(tǒng)的處理效果。一般投加到處理系統(tǒng)中的微生物可以是原處理體系的，經(jīng)馴化、富集、篩選、培養(yǎng)使原系統(tǒng)的微生物組成形成對某些難降解有機(jī)物有更強(qiáng)去除效果的穩(wěn)定微生物體系。另一種方式是向處理系統(tǒng)中投加原來不存在的外源微生物，使體系原本無法處理的污染物得到有效去除。通常這2種強(qiáng)化方法在實(shí)際應(yīng)用中都有采用，這主要取決于原有處理系統(tǒng)中的微生物組成和所處的環(huán)境。第6頁/共22頁1.3存在的問題首先，雖然已經(jīng)篩選到許多有機(jī)農(nóng)藥降解菌，但高效菌種不多；其次，降解菌的降解譜不夠廣，不能完全代謝有機(jī)農(nóng)藥中各組分；另外，許多實(shí)驗(yàn)室得到的高效降解菌在實(shí)際應(yīng)用中效率不高，修復(fù)效果不理想。第7頁/共22頁分子生物學(xué)的發(fā)展為人們提供了修飾微生物遺傳組成的技術(shù)，可構(gòu)建新的微生物。這些新的微生物具有現(xiàn)有微生物不具備的分解代謝能力，或者能在現(xiàn)有微生物不適合的條件下進(jìn)行分解活動(dòng)。這對于提高降解速率、增強(qiáng)生物修復(fù)效果是非常重要的。2.有機(jī)農(nóng)藥微生物降解機(jī)理第8頁/共22頁構(gòu)建高效降解菌的基本策略可從優(yōu)化污染物的降解途徑、提高污染物的生物可利用性和增強(qiáng)降解菌的環(huán)境適應(yīng)性等方面考慮?；舅悸酚兄亟M互補(bǔ)代謝途徑及改變污染物代謝產(chǎn)物流向、重組表面活性劑編碼基因、重組污染物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因等。主要構(gòu)建技術(shù)有基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)等，其中細(xì)胞工程技術(shù)主要是細(xì)胞融合技術(shù)。第9頁/共22頁農(nóng)藥的生物降解性研究是構(gòu)建基因工程菌的前提和基礎(chǔ)，主要包括農(nóng)藥降解菌株的篩選及其降解特性研究和農(nóng)藥降解途徑與降解酶的研究。第10頁/共22頁2.1農(nóng)藥降解菌的篩選及其降解特性的研究

為獲取降解農(nóng)藥的微生物菌株，可以從現(xiàn)已收藏的菌種中篩選，亦可以從污染環(huán)境中直接篩選或經(jīng)富集培養(yǎng)獲得。降解菌的富集培養(yǎng)方法主要有：液體培養(yǎng)法、土壤環(huán)流法、連續(xù)流動(dòng)法。通常是從長期被某種農(nóng)藥污染的土壤、水體或底泥中取樣經(jīng)富集培養(yǎng)，再經(jīng)固體培養(yǎng)分離純化得到所需菌株。第11頁/共22頁2.2農(nóng)藥降解途徑和降解酶的研究綜合來說，農(nóng)藥微生物降解的途徑包括氧化、還原、水解、脫鹵、縮合、脫羧、異構(gòu)化等過程。大多數(shù)農(nóng)藥的微生物降解途徑已經(jīng)比較清楚。第12頁/共22頁農(nóng)藥的微生物降解難易程度取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和降解酶的適應(yīng)性。研究表明，微生物降解農(nóng)藥一般有2種方式：一種是以農(nóng)藥作為唯一碳源和能源，對于含氮或磷的農(nóng)藥，有的微生物也能以農(nóng)藥為唯一氮源或磷源進(jìn)行代謝；另一種是將農(nóng)藥與其它有機(jī)質(zhì)進(jìn)行共代謝。第13頁/共22頁3農(nóng)藥降解基因工程菌的構(gòu)建3.1農(nóng)藥降解基因工程菌的構(gòu)建策略構(gòu)建高效的基因工程菌可以顯著地提高對污染物的降解效率。環(huán)境微生物中污染物降解基因、降解途徑等許多污染物降解機(jī)制的闡明為構(gòu)建具有高效降解性能的污染物降解基因工程菌提供可能。第14頁/共22頁3個(gè)角度來構(gòu)建高效基因工程菌：一是通過重組互補(bǔ)代謝途徑、改變污染物代謝產(chǎn)物流向和同源基因體外隨機(jī)拼接來優(yōu)化污染物的降解途徑；二是通過重組表面活性劑編碼基因和重組污染物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因來提高污染物的生物可利用性；三是通過重組微生物抗性機(jī)制相關(guān)編碼基因來增強(qiáng)降解性微生物的環(huán)境適應(yīng)性。第15頁/共22頁3.2農(nóng)藥降解菌基因工程的研究概況研究表明，污染物降解酶由降解質(zhì)?；蛉旧w基因編碼。降解質(zhì)粒和染色體基因可能分別編碼某一污染物不同降解途徑的酶，兩者相互補(bǔ)充。利用降解質(zhì)粒的相容性，能將降解不同污染物的高效專一的質(zhì)粒組合到一個(gè)菌株，組建成一個(gè)多質(zhì)粒的可同時(shí)降解多種不同污染物或能夠完成某一污染物降解過程的多個(gè)環(huán)節(jié)的新菌株。新菌株不僅效率高、功能多、對溫度和pH值的適應(yīng)范圍廣，而且生長條件可以根據(jù)使用條件的不同進(jìn)行調(diào)整，甚至可以成為極端菌以適應(yīng)極其惡劣的自然環(huán)境。第16頁/共22頁3.3農(nóng)藥降解基因工程菌構(gòu)建中存在的問題利用降解質(zhì)粒的相容性和自由轉(zhuǎn)移性，可以使一個(gè)菌株內(nèi)存在許多具高效降解能力的質(zhì)粒。但是，過多的質(zhì)粒存在于同一菌株細(xì)胞中將會(huì)增大細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，從而使菌株生長和繁殖速度在一定程度上減慢，這就不利于污染物的高效處理。還一個(gè)問題是由于質(zhì)粒容易在微生物的繁殖過程中遺失，這對微生物降解能力的長期穩(wěn)定性非常不利。第17頁/共22頁質(zhì)粒本身除了相容性外，還具不相容性，這樣使得質(zhì)粒的一些好的性狀不能夠通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而組合到同一菌株細(xì)胞中，給構(gòu)建多質(zhì)粒的工程菌帶來一定困難。再者，質(zhì)粒很容易受外界因子的影響，使得它的降解能力下降，甚至喪失，并且降解性質(zhì)粒除了編碼已知的降解能力外，還可能編碼一些目前已知或未知的與降解能力無關(guān)或不利降解的功能，它們的存在和表達(dá)不利于菌株高效地降解污染物。第18頁/共22頁利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行降解工程菌育種的研究取得很好的成績，但是，利用此技術(shù)最主要的困難是便于檢測的遺傳標(biāo)記的尋找。常規(guī)的遺傳標(biāo)記如抗藥性等通過誘變后可得到，但細(xì)胞降解酶活性通過誘變作用后可能會(huì)降低，甚至喪失，這樣合適的遺傳標(biāo)記很難找到。另一個(gè)問題是原生質(zhì)體融合技術(shù)在構(gòu)建工程菌過程中使得不必要或?qū)到饽芰Σ焕幕蛘系骄曛?，使得其降解能力有所下降。?9頁/共22頁通過生物工程技術(shù)構(gòu)建的具有高效降解能力的工程菌進(jìn)入自然環(huán)境后，存在著很大的安全隱患，可能對人類自身的生存和生態(tài)環(huán)境的平衡造成不利影響。所以，用于環(huán)境污染物處理的工程菌應(yīng)用的安全性問題是人類最關(guān)注的問題，它對環(huán)境和人類造成的影響是長期的，不是在很短的時(shí)間內(nèi)就能檢測到的，并且也沒有一個(gè)很有效的手段和方法對其進(jìn)行預(yù)測。第20頁/共22頁有機(jī)農(nóng)藥污染微生物修復(fù)是一種高效、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)可承受的清潔技術(shù)，值得大力推廣。在農(nóng)藥降解菌的篩選和農(nóng)藥降解