離心分離技術(shù)演示文稿

離心分離技術(shù)演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共83頁(yè)。（優(yōu)選）離心分離技術(shù)當(dāng)前2頁(yè)，總共83頁(yè)。離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。離心分離離心沉降利用固液兩相的相對(duì)密度差無(wú)孔轉(zhuǎn)鼓或管子懸浮液離心過(guò)濾利用離心力并通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)有孔轉(zhuǎn)鼓懸浮液離心分離和超離心利用不同溶質(zhì)顆粒在溶液各部分分布的差異無(wú)孔轉(zhuǎn)鼓或管子不同相對(duì)密度液體當(dāng)前3頁(yè)，總共83頁(yè)。§4.1離心沉降當(dāng)懸浮液靜止不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用，較大的懸浮顆粒會(huì)逐漸沉降，顆粒越重下沉越快，反之會(huì)上浮。但很小的顆粒不僅沉降速度慢，而且擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重，很難或根本無(wú)法沉降。這樣就需離心的方法產(chǎn)生出離心力場(chǎng)，使之產(chǎn)生沉降。一、離心沉降原理當(dāng)前4頁(yè)，總共83頁(yè)。1、離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開(kāi)旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。當(dāng)前5頁(yè)，總共83頁(yè)。根據(jù)Fr對(duì)離心機(jī)分類(lèi)：常速離心機(jī):Fr＜3000g

中速離心機(jī):

3000g＞Fr

＜50000g

高速離心機(jī):

Fr＞50000g

超高速離心機(jī):

Fr

=20000-1000000g同一樣品在不同的離心機(jī)上離心力不同當(dāng)前6頁(yè)，總共83頁(yè)。2、相對(duì)離心力（relativecentrifugalforce，RCF）常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。當(dāng)前7頁(yè)，總共83頁(yè)。

在說(shuō)明離心條件時(shí)，低速離心通常以轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示（r/min），如4000rpm；而在高速離心時(shí)，特別是在超速離心時(shí)，往往用相對(duì)離心力來(lái)表示，如65000g。

當(dāng)前8頁(yè)，總共83頁(yè)。3、沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）根據(jù)1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。以Svedberg表示，簡(jiǎn)稱S。沉降系數(shù)S與分子量M有對(duì)應(yīng)關(guān)系：R——?dú)怏w常數(shù)；T——溫度（K）；S——沉降系數(shù)（s）；D——粒子擴(kuò)散系數(shù)；υ——粒子的偏比容（粒子密度的倒數(shù)）；ρ——溶劑密度。當(dāng)前9頁(yè)，總共83頁(yè)。4、沉降速度（sedimentationvelocity）

沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρP為粒子的密度；ρm為介質(zhì)的密度。

從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場(chǎng)增大，粒子的沉降速度也增加。當(dāng)前10頁(yè)，總共83頁(yè)。①當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。當(dāng)前11頁(yè)，總共83頁(yè)。5、沉降時(shí)間（sedimentationtime，Ts）式中：Xmax為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；Xmin為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離；Ts以小時(shí)為單位，S以Svedberg為單位。

6、K系數(shù)（kfactor）K系數(shù)是用來(lái)描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。其中Rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；Rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。

當(dāng)前12頁(yè)，總共83頁(yè)。二、離心沉降設(shè)備離心機(jī)可分為工業(yè)用離心機(jī)和實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)又分為制備性離心機(jī)和分析性離心機(jī)。

制備性離心機(jī)主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大;

分析性離心機(jī)一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為（用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和相對(duì)分子質(zhì)量等。分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。當(dāng)前13頁(yè)，總共83頁(yè)。①瓶式離心機(jī)②管式離心機(jī)③多室式離心機(jī)④碟式離心機(jī)⑤螺旋卸料沉降離心機(jī)離心沉降設(shè)備當(dāng)前14頁(yè)，總共83頁(yè)。1.瓶式離心機(jī)外擺式角式固定式當(dāng)前15頁(yè)，總共83頁(yè)。

離心管

離心管主要用塑料和不銹鋼制成：

塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。

塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒置不漏液。管蓋有三種作用：①防止樣品外泄。用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時(shí)，這點(diǎn)尤其重要。②防止樣品揮發(fā)。③支持離心管，防止離心管變形。當(dāng)前16頁(yè)，總共83頁(yè)。2.管式離心機(jī)當(dāng)前17頁(yè)，總共83頁(yè)。3.多室式離心機(jī)缺點(diǎn)：出渣比較困難。適用于處理直徑大于0.1μm的顆粒，固相濃度小于5%的懸浮液，常用于抗菌素液液萃取分離，果汁和酒類(lèi)飲料的澄清等。轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有數(shù)個(gè)同心圓筒組成的環(huán)隙狀分離室。各分離室的流道串聯(lián)。操作時(shí)，懸浮液自中心進(jìn)料管加入轉(zhuǎn)鼓中，由內(nèi)向外順序流經(jīng)各分離室。在逐漸增大的離心力作用下，懸浮液中的粗顆粒沉積在內(nèi)部的分離室壁上，細(xì)顆粒沉積在外部的分離室壁上。當(dāng)前18頁(yè)，總共83頁(yè)。4.碟片式離心機(jī)

碟式離心機(jī)是立式離心機(jī)的一種，轉(zhuǎn)鼓裝在立軸上端，通過(guò)傳動(dòng)裝置由電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)而高速旋轉(zhuǎn)。當(dāng)前19頁(yè)，總共83頁(yè)。轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有一組錐頂角為60－100度的的互相套疊在一起的碟形零件--碟片。碟片與碟片間的距離用附于碟片背面的具有一定厚度的狹條來(lái)控制，碟片的距離為０.5~2.5mm。當(dāng)轉(zhuǎn)鼓連同碟片以高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，碟片間的懸浮液中的固體顆粒因其有較大的質(zhì)量，優(yōu)先沉降于碟片的內(nèi)腹面，并連續(xù)向鼓壁方面沉降，澄清的液體則被迫反方向移動(dòng)而在轉(zhuǎn)頸部進(jìn)液管周?chē)呐乓嚎谂懦觥３猎氐砻婊瑒?dòng)而脫離碟片并積聚在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)直徑最大的部位，分離后的液體從出液口排出轉(zhuǎn)鼓。當(dāng)前20頁(yè)，總共83頁(yè)。.碟片的結(jié)構(gòu)是：1.碟片用薄的不銹鋼沖成；2.碟片呈圓臺(tái)形；3.在碟片上開(kāi)有對(duì)稱的孔。當(dāng)前21頁(yè)，總共83頁(yè)。碟式分離機(jī)轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有一組碟片，把轉(zhuǎn)鼓空間分成許多薄層分離空間，從而大大縮短沉降距離，改善和提高分離效果。任何處于兩碟片之間的極限顆粒若能在此路程段中到達(dá)碟片內(nèi)表面，則可以被分離出來(lái)。顆粒在分離空間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)路線當(dāng)前22頁(yè)，總共83頁(yè)。卸渣方式

a.人工排渣的碟片離心機(jī)

b.噴嘴排渣碟片式離心機(jī)

c.活門(mén)排渣碟片式離心機(jī)

d.活門(mén)排渣的噴嘴碟片式離心機(jī)當(dāng)前23頁(yè)，總共83頁(yè)。臥式螺旋卸料沉降離心機(jī)是利用離心沉降原理分離懸浮液的設(shè)備，它主要用于完成固液相有密度差的懸浮液的固相脫水，液相澄清，粒度分級(jí)，濃縮等工藝過(guò)程。5.螺旋卸料沉降離心機(jī)當(dāng)前24頁(yè)，總共83頁(yè)。原理：轉(zhuǎn)鼓與螺旋以一定差速同向高速旋轉(zhuǎn)，物料由進(jìn)料管連續(xù)引入輸料螺旋內(nèi)筒，加速后進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，在離心力場(chǎng)作用下，較重的固相物沉積在轉(zhuǎn)鼓壁上形成沉渣層。輸料螺旋將沉積的固相物連續(xù)不斷定推至轉(zhuǎn)鼓錐端，經(jīng)排渣口排出機(jī)外，較輕的液相物則形成內(nèi)層液環(huán)，由轉(zhuǎn)鼓大端溢流口連續(xù)溢出轉(zhuǎn)鼓，經(jīng)排液口排出機(jī)外。當(dāng)前25頁(yè)，總共83頁(yè)。當(dāng)前26頁(yè)，總共83頁(yè)。LW型臥式螺旋卸料沉降離心機(jī)當(dāng)前27頁(yè)，總共83頁(yè)?！?-2離心過(guò)濾一、離心過(guò)濾的原理離心過(guò)濾是將料液送入有孔的轉(zhuǎn)鼓并利用離心力場(chǎng)進(jìn)行過(guò)濾的過(guò)程，以離心力為推動(dòng)力完成過(guò)濾。兼有離心和過(guò)濾的雙重作用。濾餅離心過(guò)濾機(jī)工作原理圖濾網(wǎng)當(dāng)前28頁(yè)，總共83頁(yè)。以間歇離心過(guò)濾為例，料液首先進(jìn)入裝有過(guò)濾介質(zhì)(濾網(wǎng)或有孔套筒)的轉(zhuǎn)鼓中，然后被加速到轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)速度，形成附著在鼓壁上的液環(huán)。與沉降式離心機(jī)一樣，粒子受離心力而沉積，過(guò)濾介質(zhì)則阻止粒子的通過(guò)，形成濾餅。當(dāng)懸浮液的固體粒子沉積時(shí)，濾餅表面生成了澄清液，該澄清液透過(guò)濾餅層和過(guò)濾介質(zhì)向外排出。當(dāng)前29頁(yè)，總共83頁(yè)。分批立式軸分批臥式軸二、離心過(guò)濾設(shè)備

間歇式當(dāng)前30頁(yè)，總共83頁(yè)。連續(xù)推送式連續(xù)錐形濾網(wǎng)連續(xù)式當(dāng)前31頁(yè)，總共83頁(yè)。

GT6H13臥式離心過(guò)濾機(jī)本機(jī)適宜過(guò)濾果汁或皮汁，達(dá)到液—固體分離，提高汁的純度。

自動(dòng)連續(xù)卸料離心過(guò)濾機(jī)為

(錐形轉(zhuǎn)鼓)當(dāng)前32頁(yè)，總共83頁(yè)。基本參數(shù)選擇 顆粒d,固液差,

基本型號(hào)固體物濃度 亞型 產(chǎn)物熱穩(wěn)定性 低溫離心 流量Q,規(guī)模 規(guī)格、臺(tái)數(shù) 氣溶膠,活cell密封滅菌設(shè)計(jì)§4.3離心機(jī)的選用（P66）當(dāng)前33頁(yè)，總共83頁(yè)。離心機(jī)的選擇當(dāng)前34頁(yè)，總共83頁(yè)。

包含體產(chǎn)物分離工藝（牛生長(zhǎng)激素分離提取）§4.4離心機(jī)在生物工業(yè)中的應(yīng)用（P67）當(dāng)前35頁(yè)，總共83頁(yè)?！?.5超離心法超離心法：根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量和形狀不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力，將混合物中各組分分離、濃縮、提純的方法。

當(dāng)前36頁(yè)，總共83頁(yè)。一、超離心技術(shù)的原理在某種介質(zhì)中，使一種球形粒子從液體的彎月面沉降到離心管某部(如底部)所需的時(shí)間：

當(dāng)粒子直徑和密度不同,移動(dòng)同樣距離所需的時(shí)間不同,在同樣的沉降時(shí)間,其沉降位置也不同.式中t為沉降時(shí)間，μ為懸浮介質(zhì)的粘度，d為粒子直徑，ρs為粒子密度，ρ為介質(zhì)密度；r1為旋轉(zhuǎn)軸中心到液體彎月面的距離，r2為從旋轉(zhuǎn)軸中心到離心管底部的距離。當(dāng)前37頁(yè)，總共83頁(yè)。利用它可以從組織勻漿中分離細(xì)胞器，其主要細(xì)胞成分的沉降順序，一般先是整細(xì)胞和細(xì)胞碎片，然后是核、葉綠體、線粒體、溶酶體、微粒體和核蛋白體。當(dāng)前38頁(yè)，總共83頁(yè)。二、超離心技術(shù)的分類(lèi)差速離心（一）制備性超離心（二）分析性超離心等密度離心一般密度梯度離心法密度梯度離心當(dāng)前39頁(yè)，總共83頁(yè)。

采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒在不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法。主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。（一）制備性超離心1、差速離心(Differentialcentrifugation)當(dāng)前40頁(yè)，總共83頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清夜與沉淀分開(kāi)，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)：①分離效果差；②壁效應(yīng)嚴(yán)重；③顆粒被擠壓。當(dāng)前41頁(yè)，總共83頁(yè)。當(dāng)前42頁(yè)，總共83頁(yè)。2、密度梯度區(qū)帶離心法

密度區(qū)帶離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。密度梯度系統(tǒng)：梯度介質(zhì)有足夠大的溶解度，不與分離組分反應(yīng)，不會(huì)引起分離組分的凝集、變性或失活。樣品鋪在密度梯度溶液表面，離心后形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。當(dāng)前43頁(yè)，總共83頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆?；钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。缺點(diǎn)：①離心時(shí)間較長(zhǎng)；②需要制備梯度；③操作嚴(yán)格，不宜掌握。當(dāng)前44頁(yè)，總共83頁(yè)。（1）一般密度梯度離心法

差速區(qū)帶離心法（動(dòng)態(tài)法或沉降速度法）

（Diensitygradientcentrifugation）根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。當(dāng)前45頁(yè)，總共83頁(yè)。離心過(guò)程中區(qū)帶的位置、形狀隨離心時(shí)間而改變用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒，與密度無(wú)關(guān)把樣品鋪放在一個(gè)連續(xù)的液體密度梯度上，然后進(jìn)行離心，并控制離心分離的時(shí)間，使得粒子完全沉降之前，在液體梯度中移動(dòng)而形成不連續(xù)分離區(qū)帶。該法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的粒子，與粒子密度無(wú)關(guān)。因此大小相同，密度不同的粒子(如線粒體、溶酶體和過(guò)氧物酶體)不能用此法分離。這種方法已用于RNA—DNA混合物、核蛋白體亞單位和其他細(xì)胞成分的分離。當(dāng)前46頁(yè)，總共83頁(yè)。當(dāng)前47頁(yè)，總共83頁(yè)。當(dāng)前48頁(yè)，總共83頁(yè)。（2）等密度離心

（Isopycniccentrifugation）指當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力作用下，顆粒或向下沉降或向上浮起，一直沿梯度移動(dòng)到與其密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶而分離的方法。

當(dāng)前49頁(yè)，總共83頁(yè)。處于等密度點(diǎn)的顆粒沒(méi)有重量，區(qū)帶的位置、形狀均不受離心時(shí)間的影響，體系處于動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)前50頁(yè)，總共83頁(yè)。差速區(qū)帶離心法和等密度離心法的區(qū)別差速區(qū)帶離心法等密度離心法原理依據(jù)粒子的沉降速率差異被分離依據(jù)粒子本身的密度差異被分離梯度范圍介質(zhì)的密度小于樣品中各種粒子的密度介質(zhì)的密度大于待分離樣品中各種粒子的密度時(shí)間效應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間離心，所有待分離粒子都沉降在管底長(zhǎng)時(shí)間離心，各粒子停留在等密度位置形成區(qū)帶當(dāng)前51頁(yè)，總共83頁(yè)。等密度離心差速區(qū)帶離心當(dāng)前52頁(yè)，總共83頁(yè)。（二）分析性超離心分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專(zhuān)門(mén)收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測(cè)手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程。相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定（紋影光學(xué)、吸收掃描光學(xué)系統(tǒng)）大分子純度的估計(jì)檢測(cè)大分子中構(gòu)相的變化當(dāng)前53頁(yè)，總共83頁(yè)。與制備用機(jī)型的不同點(diǎn)：

1．由于盛液器（離心池）有“光學(xué)窗口”，故受材料強(qiáng)度限制，允許轉(zhuǎn)速略低，在80000rpm以內(nèi)使用。

2．轉(zhuǎn)速與溫度直接影響測(cè)定數(shù)據(jù)，必須控制很?chē)?yán)：轉(zhuǎn)速偏差±1.5‰，溫差±0.1℃3．附有動(dòng)態(tài)光學(xué)檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。

當(dāng)前54頁(yè)，總共83頁(yè)。三、密度梯度技術(shù)

步驟：A.形成密度梯度B.加樣C.離心D.收集樣品當(dāng)前55頁(yè)，總共83頁(yè)。（一）密度梯度的作用:1、增加分離層次，提高分辨率。

2、防止溫差及振動(dòng)造成的影響。（二）對(duì)密度梯度的基本要求：

1、梯度介質(zhì)應(yīng)自身密度大，且溶解度足夠大，以便制作出密度范圍大的密度梯度。

2、理化性質(zhì)穩(wěn)定，生物惰性；離子強(qiáng)度低，滲透壓小，粘度小。

3、具某種可測(cè)性（如折射率）以測(cè)其濃度（密度），但不干擾分離組分的測(cè)定。

4、便于除去或回收。此外還有純度，價(jià)格等因素。當(dāng)前56頁(yè)，總共83頁(yè)。(三)密度梯度的設(shè)計(jì)1.梯度介質(zhì)的選用:(1)鹽梯度介質(zhì)

(2)小分子有機(jī)物如蔗糖

(3)三碘化苯衍生物

(4)有機(jī)高聚物

(5)膠態(tài)二氧化硅當(dāng)前57頁(yè)，總共83頁(yè)。⑴蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達(dá)1.33g/ml，且由于價(jià)格低容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。⑶氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類(lèi)，在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。常見(jiàn)的密度梯度材料及應(yīng)用當(dāng)前58頁(yè)，總共83頁(yè)。⑷鹵化鹽類(lèi)：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離其高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。⑸Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對(duì)生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。當(dāng)前59頁(yè)，總共83頁(yè)。2、梯度的密度范圍：

差速區(qū)帶離心：

最大密度<

組份最小密度等密度區(qū)帶離心：最小密度<組份最小密度最大密度>組份最大密度

鹽介質(zhì)離心形成的梯度范圍與介質(zhì)性質(zhì)、起始濃度、離心力大小、兩端旋轉(zhuǎn)半徑有關(guān)。當(dāng)前60頁(yè)，總共83頁(yè)。線性梯度階梯型對(duì)數(shù)型指數(shù)型線形梯度：最常用階梯梯度：梯度容量大，分離快，主要用于顆粒區(qū)帶很靠近時(shí)的等密度區(qū)帶離心。適用于亞細(xì)胞器、整細(xì)胞和病毒。凹形梯度（對(duì)數(shù)型）：常用等密度區(qū)帶離心時(shí)，提高較低密度顆粒組分的分辨率。凸形梯度（指數(shù)型）：常用等密度區(qū)帶離心時(shí)，提高較高密度顆粒組分的分辨率。復(fù)合型梯度：包含上述一個(gè)以上的梯度形狀，一次離心即可徹底分離樣品組分。3、梯度的形狀當(dāng)前61頁(yè)，總共83頁(yè)。4、梯度的容量：

指在達(dá)到分離要求前提下，梯度介質(zhì)容納樣品的最大數(shù)量。與樣品組成，分離要求有關(guān)；與梯度總體積、斜率、介質(zhì)粘度有關(guān)；與轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)子形式有關(guān)；差速區(qū)帶離心時(shí)，與樣品體積、濃度有關(guān)。當(dāng)前62頁(yè)，總共83頁(yè)。5、密度梯度的制備（手工、梯度混合儀、離心形成法）預(yù)形成梯度：手工法、梯度混合儀法此方法要事先制備密度梯度，常用的梯度介質(zhì)主要是非離子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。離心時(shí)把樣品鋪放在梯度介質(zhì)的液面上，這個(gè)密度包括了所需要研究的密度范圍，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等時(shí)，粒子才發(fā)生沉降，并排列成不同的區(qū)帶。當(dāng)前63頁(yè)，總共83頁(yè)。用這一技術(shù)可以定量的從線粒體和過(guò)氧化物酶體中分離溶酶體。當(dāng)前64頁(yè)，總共83頁(yè)。(1)階梯梯度：用手工由底部向上分層加入漸濃的介質(zhì)溶液，由于擴(kuò)散作用可自然形成連續(xù)梯度。擴(kuò)散時(shí)間還受溫度、階梯厚度、階梯密度差的影響。(2)混合梯度法：借助梯度混合儀或自動(dòng)梯度儀，可自動(dòng)調(diào)節(jié)梯度斜率、形狀、濃度，還可同時(shí)制備幾個(gè)梯度。制成的梯度放置過(guò)久，梯度形狀、斜率會(huì)變化。當(dāng)前65頁(yè)，總共83頁(yè)。梯度混合器三種梯度形成示意圖a線性梯度b凸形梯度c凹形梯度HighdensitysolutionLowdensitysolution當(dāng)前66頁(yè)，總共83頁(yè)。自形成梯度：（3）離心平衡法

自形成梯度的等密度離心(平衡等密度離心)。平衡等密度離心常用的梯度介質(zhì)有離子型鹽類(lèi)如鉛鹽或銣鹽和三碘化苯衍生物等。離心時(shí)是把密度均一的介質(zhì)溶液和樣品混合后裝入離心管中，通過(guò)離心自形成梯度，讓粒子在梯度中進(jìn)行再分配。離心達(dá)到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度點(diǎn)的特定位置上，形成不同的區(qū)帶。當(dāng)前67頁(yè)，總共83頁(yè)。當(dāng)前68頁(yè)，總共83頁(yè)。四、離心操作

(一)加樣和離心：1.樣品準(zhǔn)備：

離心前先除去樣品中大顆粒和膠狀不溶物。要求樣液密度<梯度最大值（速度區(qū)帶離心）。樣液中含有低濃度鹽（如0.2MNaCl）可消除組分顆粒間電荷影響（減慢速度降低分辨率）。樣品中需加緩沖劑或保護(hù)劑，如酶底物、EDTA等或Ca2+、Mg2+離子。當(dāng)前69頁(yè)，總共83頁(yè)。2.加樣：頂部加樣——沉降差速區(qū)帶離心；底部加樣——漂浮差速區(qū)帶離心；中部加樣——平衡等密度離心（等密度區(qū)帶離心）；混合加樣——平衡等密度離心；

差速區(qū)帶離心：樣品須少（<5%梯度總體積），樣品不太濃（<90%梯度最小濃度）。

當(dāng)前70頁(yè)，總共83頁(yè)。

嚴(yán)格按使用說(shuō)明操作。

樣品管要充滿且配平；超離心須在低溫、真空下進(jìn)行；加速、減速須緩慢；防止擾動(dòng)梯度和區(qū)帶，降低分辨率；平衡等密度離心時(shí)，轉(zhuǎn)速不能過(guò)高。3.離心：當(dāng)前71頁(yè)，總共83頁(yè)。(二)梯度的回收1.底部收集法（穿刺法）：用一根金屬空心針從離心管底刺人管內(nèi)，不同區(qū)帶內(nèi)的組分自下而上地先后從針管內(nèi)分別流出，然后用部分收集器分別收集。從高密度開(kāi)始收集。當(dāng)前72頁(yè)，總共83頁(yè)。2.

頂部收集法：不