高效液相色譜法()

高效液相色譜法()第一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動(dòng)相柱效低（H↑，n↓）分析周期長(zhǎng)無(wú)法在線檢測(cè)2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動(dòng)相柱效高（H↓，n↑）分析時(shí)間大大縮短可以在線檢測(cè)第二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1．分析對(duì)象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè)占有機(jī)物的20%

HPLC:溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛，占有機(jī)物的80%第三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日續(xù)前2．流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）第四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的特點(diǎn)1高效能；高速度；高靈敏度；

2高度自動(dòng)化

3流動(dòng)相可選擇性范圍寬

4適用范圍廣：樣品不受揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性的限制，只要求樣品能制成液體。

5流出組分易收集。第五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的類型分配色譜吸附色譜，又稱液固色譜離子交換色譜尺寸排斥色譜，又稱凝膠色譜第六頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日一、液相色譜的速率理論

H=A＋B/u＋C·u

渦流擴(kuò)散項(xiàng)：

A=2dp

減小A的方法：填充物的平均直徑dp=3～20um，均勻填充（勻漿裝柱）§10-1液相色譜的柱效第七頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日HPLC中載體粒徑對(duì)H的影響第八頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日HPLC中載體粒徑對(duì)n的影響第九頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

分子擴(kuò)散項(xiàng)（B/u）Cd:常數(shù)Dm：組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)第十頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

分子擴(kuò)散項(xiàng):B/u→0GC:DgHPLC:Dm

Dm/Dg≈10－5

u實(shí)=3～10u最佳

B/u→0

Dmt柱溫粘度∝第十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日固定相傳質(zhì)阻抗：

HsDs：組分分子在固定液內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)Cs

：與k有關(guān)的常數(shù)df：固定液液膜厚度（鍵合相df→0）第十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日流動(dòng)相傳質(zhì)阻力Cm是與容量因子有關(guān)的常數(shù)。Csm是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。流動(dòng)相停滯區(qū)內(nèi)傳質(zhì)阻力流動(dòng)相流動(dòng)區(qū)內(nèi)傳質(zhì)阻力第十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日流動(dòng)相傳質(zhì)阻力示意圖-01第十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日流動(dòng)相傳質(zhì)阻力示意圖-02第十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日降低板高提高柱效的方法可采用減小填料的孔穴深度、粒徑，采用低粘度、低流速的流動(dòng)相，適當(dāng)提高柱溫等方法。減小填料粒度是提高柱效的最有效途徑。第十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日液相速率方程式H=A+B/u+C·uB/u→0第十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日H-uFigureofGCandHPLC第十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

二、液相色譜的柱外譜帶展寬

柱外展寬：指色譜柱外各種因素引起的峰展寬。①柱前展寬：由進(jìn)樣引起直接把樣品加在柱頂端。②柱后展寬：柱后接管和檢測(cè)器流通池。由于流動(dòng)相在管壁附近處的流速明顯快于管中心區(qū)域的流速，從而導(dǎo)致柱外譜帶展寬。第十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日§10-2高效液相色譜儀

一高效液相色譜儀的組成部分

Ⅰ高壓輸液系統(tǒng)

Ⅱ進(jìn)樣系統(tǒng)

Ⅲ分離系統(tǒng)

Ⅳ檢測(cè)系統(tǒng)

Ⅴ附屬系統(tǒng)第二十頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日記錄儀檢測(cè)器組分收集器進(jìn)樣器儲(chǔ)液器高壓泵梯度洗脫裝置試樣

色譜柱第二十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日二主要部件及作用

Ⅰ對(duì)高壓泵的要求：

1）有足夠的輸出壓力，25～40MPa；

2）輸出流量恒定，其流量精度1%～2％；

3）輸出流量范圍可調(diào)；

4）壓力平穩(wěn)，無(wú)脈動(dòng)；

5）泵室體積?。ī?.5ml），抗腐蝕性強(qiáng).（一）高壓輸液系統(tǒng)第二十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

高壓泵分類1、恒壓泵分類：液壓隔膜泵和氣動(dòng)放大泵。特點(diǎn)：恒壓但不恒流。應(yīng)用：勻漿裝柱。

2、恒流泵分類：螺旋注射泵和柱塞往復(fù)泵。特點(diǎn)：恒流；受流動(dòng)相性質(zhì)影響小。應(yīng)用：分析。第二十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

柱塞往復(fù)泵示意圖第二十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日㈡進(jìn)樣系統(tǒng)⑴注射器：停流時(shí)進(jìn)樣，不耐壓。⑵六通閥：耐壓；進(jìn)樣量準(zhǔn)確；重復(fù)性好；可帶壓進(jìn)樣。第二十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

㈢色譜柱

材料：不銹鋼柱，內(nèi)壁需要高度光潔。柱規(guī)格：常量柱:=2.0～4.6mm,L=10～25cm

半微量柱：=1.0～1.5mm,L=10～20cm

毛細(xì)管柱：=0.5～1.0mm,L=30～75cm

實(shí)驗(yàn)室制備柱：=20～40mm,L=10～30cm第二十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日色譜柱的填充1)干法裝柱：dp＞20um2)濕法-----勻漿法：dp＜20um注：頂替液硅膠柱----------------脫水己烷鍵合固定相柱---------甲醇或丙酮離子交換樹(shù)脂柱-------緩沖溶液第二十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日勻漿的制備與裝柱

①勻漿劑：二氧六環(huán)和四氯化碳混合液為常用的勻漿劑。

②勻漿：將填料放入適量的勻漿劑中，用超聲波處理，使之成為糊狀的勻漿。③裝柱：將勻漿裝入勻漿罐中，用高壓泵以600～1000kg/cm2的壓強(qiáng)，將頂替液注入勻漿罐，把勻漿頂入色譜柱中。④結(jié)束：當(dāng)壓強(qiáng)降至100～200kg/cm2時(shí)，說(shuō)明裝柱完畢。第三十頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

勻漿裝柱示意圖第三十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

㈣檢測(cè)系統(tǒng)溶質(zhì)性檢測(cè)器：僅對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。

紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器總體檢測(cè)器：對(duì)試樣和洗脫液總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)。

介電常數(shù)檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器其它檢測(cè)器：紅外、HPLC-MS、HPLC-FTIR等。第三十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日紫外檢測(cè)器

固定波長(zhǎng)型可變波長(zhǎng)型光電二極管陣列檢測(cè)器液相色譜的檢測(cè)器中，光學(xué)檢測(cè)器使用占優(yōu)勢(shì)，紫外檢測(cè)器的應(yīng)用最廣泛，大約占70％。第三十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日第三十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日三維圖譜第三十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日第三十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

示差折光率檢測(cè)器幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。靈敏度可達(dá)10-7g·cm-3。主要缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗，使用受到限制。第三十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日LC-MS聯(lián)用技術(shù)第三十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

（五）附屬系統(tǒng)它包括脫氣、梯度洗脫、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置．其中梯度洗脫裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。梯度洗脫(gradselution)：就是在分離過(guò)程中使兩種或兩種以上不同性質(zhì)但可以互溶的溶劑，按一定程序連續(xù)改變它們之間的混合比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。（應(yīng)用于樣品組分復(fù)雜，性質(zhì)差別小即容量因子范圍寬）第三十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日梯度洗脫第四十頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日梯度洗脫裝置第四十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日§10-3分配色譜分配色譜分為：液液色譜和化學(xué)鍵合色譜一、液-液分配色譜法（LLPC）

在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無(wú)論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物．第四十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日1．分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)．所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分．第四十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日2．固定相

由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)單．只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題．為了更好解決固定液在載體上流失問(wèn)題．產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相．它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法．第四十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日3．流動(dòng)相

在液液色譜中為了避免固定液的流失．對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好．根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜．正相液相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。

其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反相液相色譜：固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。其流出順序是極性大的先流出，極性小的后流出。第四十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日二、鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜．由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品．由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離．化學(xué)鍵合固定相：利用化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)化學(xué)鍵把各種不同的有機(jī)分子鍵合到載體表面上所形成的固定相稱為化學(xué)鍵合固定相反向鍵合色譜法：固定相鍵合有疏水基團(tuán)的色譜法。

正向鍵合色譜法：固定相鍵合有極性基團(tuán)的色譜法第四十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日（一）化學(xué)鍵合固定相用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠．利用硅膠表面的硅醇基(Si-OH)與有機(jī)分子之間成鍵,即可得到各種性能的固定相．一般可分二類．1）疏水基團(tuán)

如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（C8和C18．）和苯基等．（2）極性基團(tuán)

如氨丙基（-C3H6NH2)，氰乙基(-C2H4CN)、二醇(-C3H6OCH2CHOHCH2OH)、氨基(-[CH2]3NH2)等．

第四十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日鍵合固定相的制備

R1、R2

：－CH3、－H、－Cl應(yīng)用最廣泛的是有機(jī)氯硅烷與硅膠表面反應(yīng)形成的硅氧烷涂層（≡Si—O－Si－C）

這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)．能在70℃以下，pH=2~8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛.

第四十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日（二）固定相和流動(dòng)相的選擇分配色譜中要綜合考慮反向物質(zhì)、固定相和流動(dòng)相三者之間分子的作用力才能獲得好的分離效果。選擇柱子類型方式：固定相的極性與分析物質(zhì)的極性粗略匹配，用極性明顯不同的流動(dòng)相洗脫。如反向鍵合色譜多采用水－乙醇體系改善分辨率的三個(gè)途徑：改變n、k和α。其中k很大程度上取決于流動(dòng)相的組成，最易調(diào)節(jié)，是改善分辨率的首選方法。K最佳范圍2～5，復(fù)雜組分可擴(kuò)大到0.5～20第四十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日與溶質(zhì)分子有強(qiáng)烈作用的溶劑稱為極性溶劑。溶劑的極性可定量地用Snyder的極性指數(shù)P`描述。參數(shù)P`用物質(zhì)在三種溶劑（二氧六環(huán)、硝基甲烷、乙醇）中溶解度來(lái)度量。極性指數(shù)不是連續(xù)遞減，采用混合溶劑法，以達(dá)到所希望的極性指數(shù)。

P`AB=ψ`AP`A+ψ`BP`B

通過(guò)調(diào)節(jié)極性指數(shù)，進(jìn)而調(diào)節(jié)k。改變選擇性的最方便途徑是，固定預(yù)確定的k值，改變流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)。見(jiàn)P392第五十頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日鍵合相色譜的最大優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)改變流動(dòng)相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）．此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗．據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有8O％的分離問(wèn)題是用鍵合相色譜法解決．此法的最大缺點(diǎn)：不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系．第五十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日三、洗脫物的流出順序

把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用水與有機(jī)溶劑所組成的極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離有機(jī)化合物時(shí)，一方面，組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會(huì)從水中被“擠”出來(lái)，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，使它離開(kāi)固定相，減少保留值，此即解締過(guò)程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。一般地，固定相的烷基或被分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動(dòng)相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強(qiáng)，分配比也越大，保留值越大。反相鍵合相色譜1．分離機(jī)制：疏溶劑理論第五十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問(wèn)題）2．固定相：極性小的烷基鍵合相C8柱，C18柱3．流動(dòng)相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動(dòng)相極性>固定相極性底劑+有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈第五十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日正相鍵合相色譜1．分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動(dòng)相：極性小底劑+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．出柱順序：極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱第五十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日反相離子對(duì)色譜法

反相色譜中，在極性流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使被測(cè)組分與其中的反離子形成中性離子對(duì)，增加k和tR，以改善分離。1）離子對(duì)試劑：烷基磺酸鈉→分析堿四丁基季胺鹽→分析酸2）影響k的因素a．與m的極性有關(guān)（同反相色譜）b．與R的鏈長(zhǎng)有關(guān)：R↑長(zhǎng)，極性↓小，tR↑，k↑3）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿第五十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日§10-4液固吸附色譜法

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心．液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的．一、固定相吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等．由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如試樣容量大，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多．第五十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日硅膠的表面為硅醇和硅氧烷基一般認(rèn)為，微酸性的硅醇官能團(tuán)在分離中起重要作用，而硅氧烷基影響很少或沒(méi)有影響。硅醇官能團(tuán)在相鄰硅原子上的酸性最強(qiáng)的羥基容易形成分子內(nèi)氫鍵，引起色譜峰拖尾。通常加入極性改性劑（水）來(lái)避免化學(xué)吸附和色譜峰的拖尾。第五十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日二、保留機(jī)制當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子．同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分子。于是，在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附:

Xm+nMad=Xad+nMm第五十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日達(dá)平衡時(shí)：其中K為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫．K值小,則保留值弱，易于洗脫．試樣中各組分據(jù)此得以分離．K值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出．吸附劑吸附試樣的能力取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣分子的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)。第五十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日三、流動(dòng)相一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑．在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑．洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來(lái)衡量．ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)．吸附色譜中選擇溶劑的方法：選擇兩個(gè)共存的溶劑，其中一個(gè)的強(qiáng)度參數(shù)ε0較大，另一個(gè)則很小，通過(guò)改變兩種溶劑的體積，以獲得適宜的k值。ε0增加0.05個(gè)單位，k值降低3～4倍。應(yīng)用：最適宜分離溶解在非極性溶劑中，具有中等相對(duì)分子量且為非離子型的試樣。特別適于分離異構(gòu)體。第六十頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日§10-5離子交換色譜和離子色譜利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法．凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離．它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子．因此，應(yīng)用范圍較廣．第六十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日一、離子交換平衡

離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽(yáng)離子交換：陰離子交換：

第六十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日一般形式：R一A＋B＝R－B＋A達(dá)平衡時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：KBA越大，說(shuō)明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫．一般說(shuō)來(lái)，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，K值就越大．離子交換色譜中，通過(guò)控制流動(dòng)相中反離子的濃度、離子強(qiáng)度和離子類型等，可調(diào)整被分析組分的k值，獲得好的選擇性和柱效。第六十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日

二、固定相

作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見(jiàn)下表）第六十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日3．流動(dòng)相

離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）水的緩沖溶液。通過(guò)改變流動(dòng)相中反離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加反離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。一般，對(duì)于陰離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，各種陰離子的滯留次序?yàn)椋簷幟仕犭x子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-

所以用檸檬酸離子為反離子洗脫試樣時(shí)要比用氟離子快．

第六十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日陽(yáng)離子的滯留次序?yàn)椋?/p>

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg2+＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十

但差別不如陰離子明顯．關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。第六十六頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日四、離子色譜法離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法．由于離子交換色譜法在無(wú)機(jī)離子的分析和應(yīng)用中受到限制．例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)而無(wú)法檢測(cè)為了解決這一問(wèn)題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無(wú)機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)．他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂．第六十七頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量．這種色譜技術(shù)稱為離子色譜．若樣品為陽(yáng)離子，用無(wú)機(jī)酸（HCl)作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂．當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑的分離柱后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中：

R+-OH＋H+Cl-→R+-Cl十H2O

經(jīng)抑制柱后，大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響．不再干擾測(cè)定。第六十八頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日若樣品為陰離子，用碳酸氫鈉作洗脫劑，抑制柱為酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂．柱流出液在抑制柱中反應(yīng)生成弱電解質(zhì)H2CO3,對(duì)電導(dǎo)測(cè)定沒(méi)有明顯影響。雙柱離子色譜在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜法．雙柱法的優(yōu)點(diǎn)：降低了流動(dòng)相的總離子含量，提高了檢測(cè)試樣離子的靈敏度。雙柱法的缺點(diǎn)：抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度．第六十九頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日單柱離子色譜（非抑制型離子色譜）只有一根分離柱，不用抑制柱流動(dòng)相直接進(jìn)入電導(dǎo)檢測(cè)器。單柱離子色譜采用低濃度的洗脫液，以降低流出液的本底電導(dǎo)；采用低容量的離子交換樹(shù)脂，使保留值保持不變。優(yōu)點(diǎn)：減少了抑制柱帶來(lái)的死體積，分離效率高，并能用普通HPLC改裝，發(fā)展迅速。缺點(diǎn)：不能在高電導(dǎo)介質(zhì)中測(cè)定低含量的離子。廣泛用于分析痕量陰、陽(yáng)離子。第七十頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日§10-5尺寸排斥色譜尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離．與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的．

尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來(lái)分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布．第七十一頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日一、分離原理尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法．其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大．凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱．這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出．

第七十二頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日分離原理色譜流出曲線b1b2

cbab3ca第七十三頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日第七十四頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日V0VpAC選擇滲透全滲透排斥相對(duì)分子質(zhì)量106107105104103洗脫體積AC第七十五頁(yè)，共八十三頁(yè)，2022年，8月28日它具有其他液相色譜所沒(méi)有的特點(diǎn)：