餐飲具的微生物檢驗技術

關于餐飲具的微生物檢驗技術第1頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

飲食業(yè)食飲具消毒是控制腸道傳染病發(fā)生和流行的重要環(huán)節(jié)之一，現行有效的國家標準為GB14934-94食（飲）具消毒衛(wèi)生標準。該標準適用于賓館、飯店、餐廳、食堂等飲食企業(yè)的食（飲）具，也適用于個體攤點的食（飲）具。第2頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日一、餐飲具消毒指標(感官指標、理化指標、細菌指標)1感官指標

1.1物理消毒（包括蒸汽、煮沸等熱消毒）：食（飲）具必須表面光潔、無油漬、無水漬、無異味。

1.2化學消毒：食（飲）具表面必須無泡沫、無洗消劑的味道，無不溶性附著物。

第3頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日2理化指標

采用化學消毒的食（飲）具，必須用潔凈水清洗，消除殘留的藥物。用含氯洗消劑消毒的食（飲）具表面殘留量，應符合表1的要求。

表1理化指標項

目指

標游離性余氯，mg/L<0.3烷基（苯）磺酸鈉，mg/100cm2<0.1第4頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3細菌指標

采用物理或化學消毒的食（飲）具均必須達到表2的要求。（發(fā)酵法與紙片法任何一法的檢驗結果均可作為判定依據。）

表2細菌指標項

目指

標大腸菌群發(fā)酵法,個/100cm2<3紙片法,個/50cm2不得檢出致病菌不得檢出第5頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日二采樣與檢驗方法

1發(fā)酵法檢測大腸菌群

1.1采樣方法

食（飲）具抽檢碗、盤、口杯，將2.0cm×2.5cm（5cm2

）滅菌濾紙片緊貼內面各10張（總面積50cm2、）、碟、匙、酒杯以每5件為1份，每件內面緊貼滅菌濾紙片各2張（總面積50cm2/份）,經1min，按序取置入50mL滅菌鹽水試管中，充分振蕩后，制成原液。

筷：取每雙的下段12cm處約50cm2（l2cm×2cm×2cm），置入50mL滅菌鹽水試管中，充分振蕩20次，制成原液。

第6頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日第7頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日1.2操作步驟1.2.1初發(fā)酵試驗選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24h±2h產氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產氣者進行復發(fā)酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。第8頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日1.2.2復發(fā)酵試驗

用接種環(huán)從產氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。

第9頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日1.2.3大腸菌群最可能數（MPN）的報告

按1.2.2確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見GB4789.3-2010附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。第10頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日1.2.4MPN表(GB4789.3-2010附錄B)表B大腸菌群最可能數.doc第11頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日2紙片法檢測大腸菌群

食（飲）具消毒采用專用的大腸菌群快速檢驗紙片。

2.1采樣方法

隨機抽取消毒后準備使用的各類食具（碗、盤、杯等），取樣量可根據大、中、小不同飲食行業(yè),每次采樣6～10件,每件貼紙片兩張,每張紙片面積25cm2（5cm×5cm）用無菌生理鹽水濕潤大腸菌群檢測用紙片后，立即貼于食具內側表面，30s后取下，置于無菌塑料袋內。

筷子以5只為一件樣品，用毛細吸管吸取無菌生理鹽水濕潤紙片后，立即將筷子進口端（約5cm）抹拭紙片，每件樣品抹拭兩張，放入無菌塑料袋內。第12頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日2.2檢驗方法

將已采樣的紙片置37℃培養(yǎng)16～18h，若紙片保持紫藍色不變?yōu)榇竽c菌群陰性，紙片變黃并在黃色背景上呈現紅色斑點或片狀紅暈為陽性。

第13頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

致病菌檢驗

GB4789.4-2010沙門氏菌檢驗.mht

GB4789.10-2010金黃色葡萄球菌檢驗.mht

GB/T4789.5-2003志賀氏菌檢驗.mht

GB/T4789.11-2003溶血性鏈球菌檢驗.mht3.1沙門氏菌檢驗第14頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日沙門氏菌屬簡介

沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學相關的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結構復雜，現已發(fā)現3000多個血清型，我國已發(fā)現血清型近200個。形態(tài)特征：

革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運動力強。第15頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日傷寒沙門氏菌

沙門氏菌典型群落第16頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日檢樣25g(ml)樣品+225mlBPW1ml+TTB10ml1ml+SC10ml36℃±1℃，8h-18hBSXLD(或HE、顯色培養(yǎng)基)挑取可疑菌落

42℃±1℃，18h~24h

36℃±1℃，18h~24h36℃±1℃，40h~48h36℃±1℃，18h~24h沙門氏菌檢驗程序第17頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)+A1A2A3反應結果與左側描述不符

甘露醇+、山梨醇+

ONPG-

沙門氏菌，血清學試驗

非沙門氏菌

報告TSI，賴氨酸，NA，靛基質，尿素（pH7.2），KCN第18頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3.2.2操作步驟

(1)前增菌

無菌操作將樣品轉至500mL錐形瓶中，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。

(2)增菌

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉種于10mLTTB內，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時，另取1mL，轉種于10mLSC內，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

(3)分離培養(yǎng)

分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表1。

第19頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現大的帶光澤的黑色中心，或呈現全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進行判定。第20頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日(4)生化試驗

①接種三糖鐵瓊脂自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內，沙門氏菌屬的反應結果見表2。

第21頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內的反應結果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產氣硫化氫

KA＋（－）＋（－）＋可疑沙門氏菌屬KA＋（－）＋（－）－可疑沙門氏菌屬AA＋（－）＋（－）＋可疑沙門氏菌屬AA＋/－＋/－－非沙門氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙門氏菌注：K：產堿，A：產酸；＋：陽性，－：陰性；＋（－）：多數陽性，少數陰性；＋/－：陽性或陰性第22頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日②其他生化試驗:接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時,可直接接種蛋白胨水（供做靛基質試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h，按表3判定結果。將已挑菌落的平板儲存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復查。表3沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表反應序號硫化氫

（H2S）靛基質pH7.2尿素氰化鉀

（KCN）賴氨酸脫羧酶A1＋－－－＋A2＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。第23頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日③結果判定:

反應序號A1：典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。表4沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸

脫羧酶判定結果－－－甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結果）－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙門氏菌個別變體（要求血清學鑒定結果）注：＋表示陽性；＋表示陰性。

注：＋表示陽性；＋表示陰性第24頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日反應序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質陽性變體兩項試驗結果均為陽性，但需要結合血清學鑒定結果進行判定。反應序號A3：補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。

第25頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日a）抗原的準備

一般采用1.2％～1.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。

O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2％～3％）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55％～0.65％半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或將菌株通過裝有0.3％～0.4％半固體瓊脂的小玻管1次～2次,自遠端取菌培養(yǎng)后再檢查。

(5)血清學鑒定

返回第26頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

b）多價菌體抗原（O）鑒定

在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min，并對著黑暗背景進行觀察，任何程度的凝集現象皆為陽性反應。c）多價鞭毛抗原（H）鑒定同b）。返回第27頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3.2金黃色葡萄球菌檢驗3.2.1檢驗程序第28頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日金黃色葡萄球菌定性檢驗程序見圖1。第29頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3.2.2增菌和分離培養(yǎng)

(1)增菌:將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長。

(2)分離培養(yǎng):將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。

(3)菌落特征:金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。

第30頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3.2.3鑒定

(1)染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5m～1m。

(2)血漿凝固酶試驗：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現凝固或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。

結果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復試驗。

第31頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3.3溶血性鏈球菌檢驗

3.3.1檢驗程序

第32頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3.3.2操作步驟(1)增菌培養(yǎng)

將樣液吸取5mL，接種于50mL葡萄糖肉浸液肉湯，或直接劃線接種子血平板。如檢樣污染嚴重，可同時按上述量接種匹克氏肉湯，經36℃士l℃培養(yǎng)24h，接種血平板。（2）形態(tài)與染色血平板上菌落為灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直徑約0.5mm～0.75mm，為圓形突起的細小菌落，乙型溶血鏈球菌周圍有2mm～4mm界限分明、無色透明的溶血圈。為革蘭氏陽性球菌。第33頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日（3）生化試驗①鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿0.2ml，加0.8mL滅菌生理鹽水，混勻，再加入18h～24h、36℃士1℃培養(yǎng)的鏈球菌培養(yǎng)物0.5mL及0.25%氯化鈣0.25ml（如氯化鈣已潮解，可適當加大至0.3%～0.35%），振蕩搖勻，置于36℃士1℃水浴中10min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置，內容物不流動），然后觀察凝固塊重新完全溶解的時間，完全溶解為陽性，如24h后不溶解即為陰性。第34頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日②桿菌肽敏感試驗挑取乙型溶血性鏈球菌液，涂布于血平板上，用滅菌鑷子夾取每片含有0.04單位的桿菌肽紙片，放于上述平板上，于36℃士1℃培養(yǎng)18h～24h，如有抑菌帶出現即為陽性，同時用已知陽性菌株作為對照。第35頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日3.4志賀氏菌檢驗GBT4789.5-2003食品衛(wèi)生微生物學檢驗志賀氏菌檢驗.pdf（1）增菌

吸取檢樣25mL，加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶內，于36℃培養(yǎng)6~8h。

培養(yǎng)時間視細菌生長情況而定，當培養(yǎng)液出現輕微混濁時即應中止培養(yǎng)。（2）分離培養(yǎng)和初步生化試驗

取增菌液1環(huán)，劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個；另取1環(huán)劃線接種于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板各1個，于36℃培養(yǎng)18~24h。志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。

第36頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日HE平板照片發(fā)酵乳糖的某種腸桿菌不發(fā)酵乳糖的某種腸道菌，而且產生硫化氫，可能是沙門氏菌

不發(fā)酵乳糖，呈藍綠色或藍色,可能就是志賀氏菌第37頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日沙門氏菌有黑色中心,如果沒有黑色中心，就很可能是志賀氏菌了。SS平板照片第38頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日不發(fā)酵乳糖發(fā)酵乳糖麥康凱平板照片菌落為粉紅色，半透明的，可能為志賀氏菌。第39頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日EMB平板照片菌落為無色半透明狀，可能為志賀氏菌。第40頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管。一般應多挑幾個菌落，以防遺漏，經36℃培養(yǎng)18~24h，分別觀察結果。

2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌志賀氏菌TSI斜面仍為紅色；底層產酸不產氣，變黃色；不產H2S，不出現黑色。第41頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日下述培養(yǎng)物可以棄去：

a.在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長的培養(yǎng)物；

b.在18~24h內發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；

c.不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的培養(yǎng)物；

d.產氣的培養(yǎng)物；

e.有動力的培養(yǎng)物；

f.產生硫化氫的培養(yǎng)物。

凡是乳糖、蔗糖不發(fā)酵，葡萄糖產酸不產氣(福氏志賀氏菌6型可產生少量氣體)，無動力的菌株，可做進一步的生化試驗和血清學分型。第42頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日(3)進一步的生化試驗

葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶、pH7.2尿素、KCN生長、水楊苷和七葉苷的分解。

志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結果(除宋內氏菌和鮑氏13型為鳥氨酸陽性外)。葡萄糖銨:陽性者斜面上有正常大小的菌落,陰性者不生長或生長極微小的菌落。西蒙氏檸檬酸鹽：陽性者斜面上菌落生長，培養(yǎng)基由綠色轉為藍色，陰性者不生長。賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶：陽性者為紫色，陰性者為黃色。pH7.2尿素：陽性者為紅色，陰性者為黃色。KCN：陽性者細菌生長，陰性者細菌不生長。水楊苷和七葉苷：陽性者產氣。第43頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

生化反應不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物。

已判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物，應進一步做5%乳糖發(fā)酵、甘露醇、棉子糖、甘油的發(fā)酵、靛基質試驗。

志賀氏菌屬4個生化群的培養(yǎng)物，應符合該群的生化特性。但福氏6型的生化特性與A群或C群相似。第44頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日志賀氏菌四個群的生化特性生化群5%乳糖